长春花不同细胞培养物中一氧乙酰化地马地宁的水解过程

杨 静 怡， 王 燕 燕， 于 放

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

单萜类吲哚生物碱(Monoterpene indole alkaloids，MIAs)具有数千种已经被报道的化学结构，是植物所具有的代谢物中最多样化的产物之一[1]。众所周知，MIAs拥有不同的生物活性，也是临床上各种药物的重要来源，包括长春花(Catharanthusroseus)中的抗癌化合物长春质碱和长春新碱等天然次生代谢物。MIAs在植物体内合成量较少，并且因其化学结构复杂，难以进行化学合成，因此在市场上往往供不应求。最近，在长春花植株代谢途径中发现了两个一氧乙酰化地马地宁(Stemmadenine-O-acetylation，OAS)的水解酶HL1和HL2。OAS首先被氧化，通过缀合亚胺的NADPH依赖性酶进行还原，再将得到的烯胺脱乙酰化/片段化，通过HL1和HL2的作用产生两种脱氢甘氨酸型中间体，经过不同的合成过程，促进了长春花植株中对长春质碱或水甘草碱的积累，近而提高了长春质碱和长春新碱的积累量，最终合成长春新碱和长春质碱。

长春花细胞培养物中除小檗碱和利舍平可进行大规模工业生产外，其他MIAs因含量低而无法进行工业化生产[3]。目前，长春花组织培养物中只能生产用于降血压和镇痛的阿吗碱和利舍平，而具有抗癌功效的长春质碱和长春新碱却无法生产。赵剑等[4]对长春花叶片进行愈伤组织诱导时发现，相对于原本叶片中文多灵和长春质碱的含量，在诱导的过程中两者迅速降解到极低水平。Goswami等[5]对长春花进行秋水仙素的处理，形成同源四倍体中MIAs含量比母本也有下降趋势。张秀省等[6]对不同长春花愈伤组织进行分析，发现经EMS诱变后的愈伤组织能产生更多的生物碱。对于长春花细胞培养物的研究从未间断过，然而却鲜有关于其分子机理及不同组织生物碱积累量系统的研究。

本研究培育了长春花5种不同愈伤组织与悬浮细胞，并且对其生长状态进行比较，采用实时荧光定量PCR和高效液相色谱方法对细胞培养物中OAS水解过程进行解析，以期为探究长春花细胞培养物的遗传转化产生MIAs提供基础。

1 试 验

1.1 材料与试剂

长春花种子、长春花无菌苗及长春花毛状根均为本实验室培育。

MS培养基、WPS培养基，海博生物公司；植物激素2，4-D和6-BA，索莱宝公司，实验室中贮备液质量浓度为2 mg/mL；反转录酶、RNA提取TRNzol试剂、没有RNA污染降解RNA中的DNA酶、DNA聚合酶、TransStart Tip Green qPCR SuperMix酶以及琼脂糖凝胶均来自全式金生物技术有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 长春花无菌苗的培养

将长春花种子作为外植体进行消毒处理，首先用流水将长春花种子冲洗干净，浸入酒精15～30 s，用无菌水冲洗2次；在95%次氯酸钠中浸泡5～7 min，使用无菌水冲洗3～5次，将灭菌的种子置于三角瓶中的MS培养基中萌发生长；在光照强度3 000 lx、时间16 h、24 ℃条件下培养，待生长到一定时间继续实验。

1.2.2 不同长春花细胞培养物的诱导

长春花愈伤组织诱导培养基：WPS培养基加入1.5 mg/L 2，4-D和1.5 mg/L 6-BA，蔗糖3%，琼脂0.8%。

长春花愈伤组织生长培养基：MS培养基加入1.75 mg/L 2，4-D和1.75 mg/L 6-BA，蔗糖3%，琼脂0.8%。在光照强度3 000 lx、时间12 h、24 ℃条件下培养。

长春花悬浮细胞液体培养基：MS培养基加入1.75 mg/L 2，4-D和1.75 mg/L 6-BA，蔗糖3%。培养基pH均为5.8。

1.2.3 不同组织长春花悬浮细胞的诱导

选取同批培养、质地疏松、分散度良好、生长旺盛均一的淡黄绿色的不同的长春花愈伤组织作为悬浮培养的材料，将不同的愈伤组织转入液体培养基中。每150 mL的三角瓶中分装50 mL 液体培养基，每瓶接种量2 g，摇瓶转速为100 r/min，温度25 ℃，黑暗条件下培养。

1.2.4 悬浮细胞生长量的测定

利用液氮研磨法破碎不同的长春花细胞培养物，利用TRNzol法提取RNA[13]，对样品RNA进行消化后将其反转录为cDNA，如表1所示。以CrACT3-F/R为引物进行生物检测，终产物利用实时定量PCR进行检测。

1.2.5 长春花细胞培养物的次级代谢产物的检测

将愈伤组织和悬浮细胞收集到2 mL离心管中。在每个离心管中加入2颗均匀氧化锆，通过高通量组织研磨仪进行破碎，加入甲醇破碎后进行超声处理，收集上清，利用真空旋干干燥仪旋至干粉。再加入500 mL甲醇溶解，将所得溶液经0.22 μm滤膜过滤后，使用HPLC进行分析检测。

色谱柱：安捷伦C18色谱柱；流动相A，乙腈；流动相B，水；V(A)∶V(B)=9∶1。检测波长：文多灵310 nm，长春质碱280 nm；体积流量1.2 mL/min，自动进样器进样量10 μL，柱温25 ℃。根据标准曲线以及样品的峰面积计算长春质碱含量。

表1 实验所用引物序列Tab.1 Primer sequence in the experiment

2 结果与分析

2.1 长春花悬浮培养细胞的生长曲线

为了选取合适的悬浮细胞材料，在细胞悬浮培养过程中，以长春花细胞通光率，即培养过程中细胞的密度作为生长指标。如图1所示，几种不同悬浮细胞的生长曲线均为S型，大致分为3个时期：延迟期、指数期和静止期，且这5种悬浮细胞的密度变化时间也较为一致。

图1 长春花不同部位细胞悬浮物培养过程中密度变化

Fig.1 The changes of cell density during cell suspension culture ofCatharanthusroseus

从图1可以看出，这几种长春花悬浮培养细胞均有比较明显的延迟期，但时间不同。愈伤组织刚接入时的液体培养基颜色较浅，并且细胞分布不均匀且稀疏，推测是由于愈伤组织的细胞暂时不适应液体培养基，这个阶段为延迟期；第二个阶段为指数生长期，培养基的颜色也逐渐加深，变为黄绿色，细胞分布均匀，并且有些悬浮细胞的培养基中出现了少量的细胞团；处于第三个阶段静止期时，培养基由黄绿色逐渐变为黄褐色或灰色，细胞密度有所降低，有些培养基中出现散乱且大量的细胞团，推测是因为培养基中细胞密度变大导致的营养成分耗尽，提供的营养物质不足所致，选取30 d左右的组织培养物作为进一步研究的材料。

2.2 长春花不同培养物中CrHL1和CrHL2的反转录鉴定

提取长春花不同悬浮细胞和愈伤组织的RNA，并反转录为cDNA，使用内参基因CrACT3进行PCR鉴定，如图2所示。条带清晰明显，证明反转录成功，进行实时定量PCR检测。

(a) 悬浮细胞

(b) 愈伤组织

1，茎；2，根；3，花；4，毛状根；5，叶

图2 长春花不同培养物中RNA的鉴定

Fig.2 Detection of RNA in differentCatharanthusroseuscultures

2.3 长春花不同培养物中CrHL1和CrHL2的相对表达量

如图3所示，不同悬浮细胞中CrHL1和CrHL2的相对表达量不同，与愈伤组织中的相对表达量也不同；而除毛状根和茎诱导而来的悬浮细胞中CrHL1的相对表达量低于CrHL2外，其余均与愈伤组织中相对表达量变化的趋势相同。不同愈伤组织中水解酶基因的相对表达量存在差异，推测是由于这5种愈伤组织来源于不同组织。不同愈伤组织中合成长春质碱前体的CrHL1的相对表达量均高于合成水甘草碱前体CrHL2。

选取实验组各3个重复生物学样本进行分析 (*P<0.05，**P<0.01)

图3 长春花不同培养物中CrHL1和CrHL2的相对表达量

Fig.3 Relative expression ofCrHL1 andCrHL2 in differentCatharanthusroseuscultures

2.4 长春花不同培养物中生物碱的积累量

选取继代后28 d左右不同长春花的愈伤组织和培养30 d左右的悬浮细胞进行HPLC检测，结果如图4所示。文多灵和长春质碱标准品上样量均为50 mg/L，对比图中不同的峰，在长春花的不同培养物中检测到存在长春质碱的积累，而没有检测到文多灵的积累。

a，文多灵标准品； b，长春质碱标准品； c，长春花叶片； d，长春花愈伤组织； e，悬浮细胞

图4 长春花不同培养物的HPLC图

Fig.4 HPLC of catharanthine in differentCatharanthusroseuscultures

不同的细胞培养物中长春质碱积累量的差异变化如图5所示，且在愈伤组织诱导生成悬浮细胞的过程中，根、花和叶悬浮细胞中长春质碱的积累分别提高了137.3%、157.5%和190.9%；茎中长春质碱积累量提高了113.5%，相较于其他悬浮细胞提高并不显著；在毛状根的愈伤组织被诱导形成悬浮细胞的过程中，长春质碱积累量降低了25.1%。

图5 长春花不同培养物中长春质碱的积累量 (*P<0.05)

Fig.5 Accumulation of catharanthine in differentCatharanthusroseuscultures

3 结论与讨论

在转录水平上，由长春花愈伤组织的代谢产物和对应的一氧乙酰化地马地宁水解酶的表达量的比较得知，CrHL1的相对表达量高于CrHL2，且终产物长春质碱得到积累，而并未检测到文多灵的合成；证明不同愈伤组织积累吲哚生物碱的过程中，当OAS水解时，代谢流更多的是向着合成长春质碱这一方向流动。而由愈伤组织形成悬浮细胞过程中，花、叶和根的CrHL1的相对表达量均升高，长春质碱的积累量也随之增加；而毛状根和茎中CrHL1的相对表达量均降低，但又由于毛状根中CrHL2的相对表达量升高，茎中CrHL2的相对表达量几乎没有变化，因而毛状根中长春质碱的积累量降低，而茎中长春质碱的积累量没有显著变化。

在次级代谢产物水平上对长春质碱合成量的能力进行对比，从宏观来看，悬浮细胞较愈伤组织更为理想。在愈伤组织诱导生成悬浮细胞的过程中，花、叶和根中长春质碱积累量增加，在这个过程中基中长春质碱的积累量没有显著的变化，但毛状根中长春质碱的积累量有所减少；其中，根诱导而来的悬浮细胞中长春质碱的积累量最高，是一种比较理想的材料。在长春花细胞培养物积累次级代谢产物的过程中还有很多的影响因素，并且整个过程复杂，能否通过单独调控CrHL1和CrHL2基因的表达改变水解过程来改变长春花细胞培养物的代谢流变化还有待探究。