不同类型肠易激综合征患者血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a水平的临床意义*

杨立顺，康建华，沈兴娅，李德来，冯绍华，李 娜

(天津市北辰中医医院检验科，天津 300400)

流行病学资料表明，我国肠易激综合征(IBS)的患病率略低于西方国家。该病以腹痛或腹部不适为主要症状，是一种常见的功能性肠病[1]，患者常伴有排便习惯改变，上述症状在排便后可有所改善。临床上可依据粪便的性状将其分为便秘型IBS、腹泻型IBS、混合型IBS及不确定型IBS。已有研究表明，各亚型IBS长期反复发作对患者生活质量的影响程度与一些慢性疾病，如糖尿病、充血性心力衰竭、肾衰竭等大体相同[2]。虽然，目前多种治疗IBS药物已应用于临床，但尚存在争议,如5-羟色胺受体拮抗剂虽然能够抑制腹泻型IBS患者小肠的运输活力，降低结肠积气，以缓解患者腹泻症状，但在患者停药后1周内易复发，不能取得满意的疗效[3]。近年学者也指出，IBS各亚型的发病机制均不是单一性的，但对于各亚型具体的发病机制仍缺乏了解[2]。

微小RNA(miRNA)是一种非编码单链RNA分子，目前在生物界被实验证实存在数目超过2万，其参与转录后基因表达调控，并对肿瘤的发生和发展起到不同层面的作用。目前，多项研究报道指出，miRNA参与IBS的发生、发展。HOU等[4]研究发现，miRNA-144的上调可通过直接靶向作用于紧密连接蛋白和胞质紧密粘连蛋白1促进肠道通透性增高并损害上皮屏障的保护作用，并认为 miRNA-144可能是肠道通透性过高的关键调节因子，可能是腹泻型IBS的潜在治疗靶点。CHAO等[5]研究显示，miRNA-29a通过降低IBS大鼠中水通道蛋白表达来增加结肠上皮细胞的肠膜通透性。HOU等[6]研究发现，miRNA-200a可通过靶向作用下调大麻素受体1和羟色胺转运体来诱导内脏痛觉过敏，加重或促进IBS的进展。然而，上述3种miRNA在不同类型IBS患者中的表达情况尚未见报道。本研究拟针对不同类型IBS患者血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性及临床意义进行分析，以期为IBS的病因学研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究主要通过病例抽样法，选取IBS患者110例为研究对象，选取同期110例体检健康者为健康对照。研究对象均抽样于本院检验科，所有患者均为首次确诊，收集时间为2015年10月至2018年6月。纳入标准：(1)自愿参与，即了解本课题组的研究目后自愿接受研究的患者；(2)符合研究标准，即由本研究署名的医院确诊且全程在该医院进行治疗的患者。排除标准：(1)1年内参与过同类型研究的患者；(2)存在精神卫生问题与心理障碍的患者；(3)中途失访的患者。

1.2方法 IBS不同类型的判定依据如下。(1)腹泻型IBS：硬便或块状便排便比例<25%，稀便(糊状便)或水样便排便比例≥25%；(2)混合型IBS：稀便(糊状便)或水样便排便比例≥25%，硬便或块状便排便比例>25%；(3)便秘型IBS：稀便(糊状便)或水样便排便比例<25%，硬便或块状便排便比例≥25%；(4)不确定型IBS：粪便的性状不符合上述三者之中的任一标准。

征得受试者同意的前提下对受试者进行生物采样。受试者采样前12 h低蛋白饮食，每位受试者取10 mL静脉血样本，静脉血3 000 r/min离心后取上清并保存于-80 ℃冰箱备用。采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)测定受试者miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平。提取血清总RNA，并采用茎环法反转录为cDNA，进行RT-PCR检测。检测条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，42个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。使用引物序列见表1。

表1 miRNA-144、miRNA-29a、miRNA-200a和U6引物序列

2 结 果

2.1不同类型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平比较 与健康对照(miRNA-144 6.16±1.44，miRNA-29a 0.21±0.05，miRNA-200a 0.14±0.03)相比，IBS患者(miRNA-144 15.92±4.86，miRNA-29a 1.40±0.27，miRNA-200a 1.33±0.20)表达水平均显著增高(P<0.05)。不同类型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平对比结果显示，混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平均显著高于其他3种亚型(P<0.05)，不确定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平均显著高于便秘型IBS及腹泻型IBS(P<0.05)。见表2。

表2 不同类型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平对比

注：a表示方差分析有统计意义的基础上与混合型IBS结果差异有统计学意义;b表示方差分析有统计意义的基础上与不确定型IBS结果差异有统计学意义。

表3 便秘型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性(r)

注：a表示P<0.05。

表4 腹泻型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性(r)

注：a表示P<0.05。

2.2不同类型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性 便秘型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性分析结果显示，miRNA-29a和miRNA-200a的表达水平存在统计学相关性(P<0.05)，而miRNA-144与miRNA-29a、miRNA-200a的表达水平不存在统计学相关性(P>0.05)，见表3。腹泻型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性分析结果显示，miRNA-29a和miRNA-200a的表达水平存在统计学相关性(P<0.05)，而miRNA-144与miRNA-29a、miRNA-200a的表达水平不存在统计学相关性(P>0.05)，见表4。混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性分析结果显示，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表达水平均存在两两之间的统计学相关性(P<0.05)，见表5。不确定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性分析结果显示，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表达水平均存在两两之间的统计学相关性(P<0.05)，见表6。

表5 混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性(r)

注：a表示P<0.05。

表6 不确定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平的相关性(r)

注：a表示P<0.05。

3 讨 论

本研究结果显示，混合型、不确定型IBS患者miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a三者的表达水平均存在两两之间的统计学相关性，但对于单纯腹泻或便秘型的IBS患者来说，仅miRNA-29a和miRNA-200a的表达水平存在统计学相关性，而miRNA-144与miRNA-29a和miRNA-200a的表达水平不存在统计学相关性。上述研究结果提示，miRNA-29a和miRNA-200a的表达可能同时参与了4型IBS的发病，且二者之间存在相互协同的正相关关系。此外，miRNA-144可能参与混合型与不确定型IBS的发病。根据相关的文献可知，miRNA介导IBS相关激惹性物质蓄积的信号通路是miRNA参与IBS发病的可能机制，且该基因对于多个细胞信号通路下游是关键的靶基因[7-9]，所以，从细胞生物学理论上来讲，可以假设miRNA是一种IBS发生的上游信使物质，但IBS的发生具体被这种上游物质通过什么样的作用模式调控，以及这种发生的概率及意义是否具有生物学和统计学方面的意义仍有待考证。

本研究还发现，混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平均显著高于其他3种亚型，而不确定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平均显著高于便秘型IBS及腹泻型IBS。有研究发现，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a可下调紧密连接蛋白、胞质紧密粘连蛋白1、水通道蛋白、大麻素受体1和羟色胺转运体等靶蛋白的表达活性，而这些靶蛋白的活性降低需要细胞外钙离子的支持，这种现象称为脱敏[4-6]。其生理学基础是钙的流入和细胞内钙的相应增加，而IBS患者大多伴有不明原因的肠道部位钝痛，且容易在不明的诱发因素下发生进一步激惹，因此，在一定程度上介导了这种效应[9]。各种信号传导途径(如钙调神经磷酸酶、钙调蛋白、磷脂酰肌醇二磷酸的减少)均与脱敏有关。有研究曾发现，IBS患者在经过较为长期的病程后会出现钙通道调控蛋白部分结构域被激活的现象，并推测其原因可能为大量钙离子的流入在一定程度上提高了痛觉触发点位的阈值[7-9]。上述均提示，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表达是IBS发病的重要基础。

另外，水通道蛋白、大麻素受体1和羟色胺转运体均具有2个特殊的末端结构(C-末端和N-末端)。C-末端主要负责参与痛觉的传递，N-末端则有一定的镇痛作用，且该作用能被纳洛酮翻转。在相关的动物模型中，实验人员模拟出受试动物形成肠道易激惹的生理环境，并通过不同的刺激模式观察miRNA-29a和miRNA-200a水平与肠道易激惹程度是否存在线性变化的关系，结果显示miRNA-29a和miRNA-200a能直接或间接诱导C-末端和N-末端的结构域发生变性，也可通过促进脑啡肽的释放进一步促进谷氨酸等的释放参与痛觉传递[5-6]。miRNA-29a和miRNA-200a可引起相应支配部位的神经区域出现血管扩张，继而导致血浆蛋白外渗等炎性反应，而这也可能是IBS患者出现不明原因钝痛且通过常规的镇痛途径效果并不明显的一个主要因素[5-6]。有研究发现，IBS出现组织损伤和随后的炎症时，各种前列腺素和缓激肽的释放也可在一定程度上诱导miRNA-29a和miRNA-200a的高表达[5-6]。同时，miRNA-29a和miRNA-200a的高表达对有害刺激(如高温)的敏感性不是静态的，某些情况下可因患者自身的生理状况发生变化出现伤害感受器对有害刺激的敏感性增加[10-11]。鉴于miRNA-29a和miRNA-200a间有紧密的作用机制，可以解释本次研究中miRNA-29a和miRNA-200a的表达水平在4种IBS亚型患者中均具有显著的相关性，表明miRNA-29a和miRNA-200a可能通过相同的作用机制促进4种IBS亚型的形成。

4 结 论

混合型与不确定型IBS患者血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达水平较便秘型IBS及腹泻型IBS 2种亚型高，且血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表达两两之间均具有显著相关性，提示miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表达可能参与了混合型与不确定型IBS的发病。