拮抗性芽孢杆菌的筛选及发酵培养基优化

曹睿琪，杜华，孙天成

（南京工业大学，江苏南京 211816）

人类在生态圈中的活动日益频繁，过度使用β内酰胺类、喹诺酮类等传统抗生素对抗细菌、真菌等有害微生物，导致部分有害微生物通过自身进化产生强耐药性。所以打破固有思维，探寻具有拮抗作用的新型抗生素在抗生素发展中显得至关重要。在众多的革兰氏阳性菌中，芽孢杆菌因为能够自产内生孢子具有拮抗作用而获得越来越多的关注。自美国科学家Jonson[1]在人体组织中分离出地衣芽孢杆菌后，作为拮抗性芽孢杆菌属中家族成员之一的地衣芽孢杆菌以其广谱、高效的抑菌特性成为生物拮抗领域的研究热点。因此以活化地衣芽孢杆菌为基础，将枯草芽孢杆菌、里氏木霉、大肠杆菌作为指示菌，对地衣芽孢杆菌进行筛选；同时用滤纸片法测定抑菌圈直径大小，分析拮抗性芽孢杆菌的抑菌性能；并采用单因素变量法，分析发酵培养基不同成分对拮抗性地衣芽孢杆菌的拮抗性能影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

指示菌：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，里氏木霉；待筛菌：地衣芽孢杆菌。菌种来源：南京工业大学国家生化工程技术研究中心。

1.1.2 细菌培养基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 mL，NaCl 5 g，淀粉30 g，浓度为3.08%浓度的MgSO410 mL，水1 000 mL[2]。

1.1.3 真菌PDA培养基

马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水1 000 mL，调至自然pH。

1.1.4 待筛菌发酵培养基

浓度为1.5%的葡萄糖，3%的蛋白胨，0.15%的CaCl2等，调pH值至中性，121 ℃灭菌30 min。

1.2 仪器设备

ZHWY-2102C恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；YX280D高压灭菌锅，上海海埃塞克生物科技有限公司；OMP200A电子天平，上海第二天平仪器厂；HI9214 pH测定仪，苏州海云天仪器仪表有限公司；500-182-30游标卡尺，上海辛睿电器科技有限公司；SP-756P紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

移液枪转移100～300 μL菌液至平板中，涂布，完成后灼烧涂布棒，再进行三区划线；杀死接种环多余菌，最后打开三区划线平板，取一个单菌落，再打开LB培养基，中间划线后进行密集划线。

1.3.2 种子液培养

取培养好的斜面，将密集划线后长好菌的平板放至室温，同时将种子液放入超净台进行紫外灭菌。

1.3.3 发酵培养

对枯草杆菌、大肠杆菌采用细菌培养基进行发酵培养，里氏木霉采用真菌发酵培养基，待筛芽孢杆菌发酵培养基见1.1.4。

1.3.4 芽孢杆菌筛选

1.3.4.1 指示平板

分别将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌和里氏木霉菌液加入到标准平板中，再分别加入3种指示菌的培养基20 mL，轻微振荡，水平放置后制备成指示菌平板[3]。

1.3.4.2 初筛

先以枯草芽孢杆菌为指示菌对地衣芽孢杆菌进行初筛，取菌株上清液过0.22 μm的滤膜，选择轻薄的纸片，将这些纸片裁剪成方形，蘸取待测地衣芽孢杆菌发酵液，将纸片均匀贴在指示平板的表面，把滤纸片周围明显产生透明抑菌圈的地衣芽孢杆菌分别编号为H29、28、30、31、32，并用游标卡尺测定5种菌株抑菌圈直径大小，筛选出拮抗作用最强的地衣芽孢杆菌。

1.3.4.3 复筛

将初筛得出的拮抗作用最强的拮抗性地衣芽孢杆菌菌株用接种环挑出，再分别用枯草芽孢杆菌、里氏木霉、大肠杆菌作为指示菌来观察抑菌圈透明圈，并用游标卡尺测量大小，验证该菌株是否具有普遍抗菌活性。

1.3.5 发酵培养基营养成分优化

对发酵培养基进行单因素实验，将复筛选出的拮抗性地衣芽孢杆菌于斜面活化，再接种后对发酵培养基营养成分进行单因素实验，继续采用滤纸片法测定产抗菌肽的该地衣芽孢杆菌的抑菌圈直径[4]。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈直径测定

如表1所示，初筛以枯草芽孢杆菌为指示菌，用游标卡尺对编号H29、28、30、31、32的5种菌株进行抑菌圈大小测量，结果32＞H29＞28＞31＞30，最大抑菌圈直径达到18.56 mm。如表2所示，复筛对32菌株进行纯培养，再以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、里氏木霉为指示菌，测定32菌株的抑菌圈大小。复筛结果表明，以枯草芽孢杆菌为指示菌时，32地衣芽孢杆菌抗菌能力最强，抑菌圈大小可达18.57 mm。

2.2 单因素实验结果

复筛结果表明，以枯草芽孢杆菌为指示菌，地衣芽孢杆菌32抑菌圈大小最大，即产抗菌肽能力最强，所以重点对地衣芽孢杆菌32进行单因素实验。以C源（葡萄糖）为单变量，设置葡萄糖浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%[4]，N源（蛋白胨）保持为3%，无机盐（CaCl2）保持为0.15%，配制5瓶培养基，再以枯草芽孢杆菌为指示菌，重复滤纸片法进行抑菌圈测定，如图1所示为抑菌圈大小。当葡萄糖量为1.0%时，地衣芽孢杆菌32抑菌圈直径最大，拮抗性能最强，且拮抗性能随葡萄糖浓度增大而下降。

表1 地衣芽孢杆菌抑菌圈测定结果（初筛）

表2 地衣芽孢杆菌抑菌圈测定结果（复筛）

图1 葡萄糖浓度对拮抗性能的影响

以N源（蛋白胨）为单变量，设置蛋白胨浓度为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%，保持C源1.0%、无机盐0.15%，配制5瓶培养基，分别得到抑菌圈大小如图2所示。当蛋白胨添加量为3.0%时，地衣芽孢杆菌32抑菌圈直径最大，拮抗性能最强。当蛋白胨浓度为2.0%～3.0%时，拮抗性能逐渐增大，而蛋白胨浓度为3.0%～4.0%时，拮抗性能逐渐减小。

以无机盐（CaCl2）为单变量，设置无机盐浓度为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%，保持C源1.0%、N源3.0%，配制5瓶培养基，分别得到抑菌圈大小如图3所示。当CaCl2添加量为0.15%时，地衣芽孢杆菌32抑菌圈直径最大，拮抗性能最强。当蛋白胨浓度为0.05%～0.15%时，拮抗性能逐渐增大，而蛋白胨浓度为0.15%～0.25%时，拮抗性能逐渐减小。

图2 蛋白胨浓度对拮抗性能的影响

图3 CaCl2添加量对拮抗性能的影响

3 结论

芽孢杆菌属中地衣芽孢杆菌具有良好的拮抗性能，在以枯草芽孢杆菌为指示菌进行初筛条件下，编号H29、28、30、31、32菌株的拮抗性能也不同。复筛时以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、里氏木霉作为指示菌对菌株32测定抑菌圈大小，发现枯草杆菌为指示菌时抑菌圈最大。单因素实验表明，葡萄糖添加量为1%、蛋白胨添加量为3%、CaCl2添加量为0.15%时，地衣芽孢杆菌32抑菌圈直径最大。