海藻渣改良栽培料对平菇多糖产量影响的研究

王盟星，朱红薇，张琳，黄乐，秦益民

（1.嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001；2.农业农村部海藻类肥料重点实验室，山东青岛 266400；3.海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛 266400）

平菇是广受大家喜爱的一种食物，不仅拥有良好的口感而且营养丰富，其中含有多糖、氨基酸、维生素等对人体有益的成分[1-4]。多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少由10个以上单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，是可以通过口服的功能性食品，不仅对人体有益，同时也具备很多临床作用[5-6]。

浙江省等沿海城市，海藻资源丰富。海藻渣则是提取海藻内海藻酸、甘露醇、碘等产品的副产物，排放到水中会与水形成胶性粘稠物，造成水体污染[7-9]。海藻渣富含蛋白质、粗纤维、微量元素和少量的糖、粗脂肪等可适用于平菇栽培，如果能够提高食用菌品质，将具有重要的经济和社会价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌种

高平58（Pleurotus ostreatus）,本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

配制 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS），AR分析纯；0.01g/mL羧甲基纤维素钠水溶液（CMC），AR分析纯；1 mmol/L ABTS溶液，AR分析纯；pH=4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，AR分析纯（济南鑫达化工有限公司）；海藻渣（青岛明月提供）。

1.1.3 主要仪器

UV-1100紫外分光光度计(济南千司生物技术有限公司)；SBA1243电子分析天平（哈尔滨德远科技开发有限公司）；Eppendorf 5810R 离心机（深圳市德优平科技有限公司）；VS-130超净台（成都宜恒实验仪器有限公司）；DVG-9070A电热恒温鼓风干燥箱（上海巨为仪器设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配置及菌种活化

制备PDA培养基，将锥形瓶中培养基融化，倒入无菌平板，待其凝固。用打孔器在普通菌种平板上打出饼状菌种，用镊子取出放入凝固后的PDA培养基上，放入37 ℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 栽培料配置

栽培基质以棉籽壳培养基为基础，加入海藻渣，其辅料配比如表1所示。

拌匀培养料的辅料，加入少量去离子水，静置发酵24 h，调节pH至中性；水分调节至用手紧握培养料之间有水珠渗出即可。分装至200 mL玻璃瓶中，在栽培料中间打一个2～3 cm深的接种孔，放入高压灭菌锅，121 ℃灭菌2 h，室温冷却。

1.2.3 接种及出菇管理

将活化后的菌种接种于栽培料中，瓶装栽培料置于28 ℃环境中，恒温培养至菌丝长满整个栽培料，打开瓶盖，将室温降至20～25 ℃，促进菌丝扭结。保持一定的湿度及栽培室内的空气流动，有一定的散射光照射。

1.2.4 多糖提取工艺优化

将烘干至恒重的子实体粉碎、过60目筛，按固液比（g∶mL）1∶15、1∶20、1∶25量取菌粉2 g及蒸馏水所需用量于锥形瓶中（每梯度各3瓶），分别在60 ℃、70 ℃、80 ℃下热水浸提1 h、2 h、3 h后抽滤、加入3倍体积的80%乙醇溶液摇匀、静置过夜。

1.2.5 多糖溶液的配制与测定

将静置过夜的提取液在4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤3次后放入1 000 mL容量瓶中充分溶解，取1 mL溶解后的多糖溶液于试管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，摇匀，缓慢加入5 mL浓硫酸后在25 ℃水浴中恒温保持30 min后取出。将配置好的溶液装于石英比色皿中，在488 nm处测定紫外吸收值。

1.2.6 粗酶液的提取

对菌菇废渣的自然pH进行测定，选取自然pH附近的缓冲溶液作为提取液。每1 kg废渣用1 L的提取液浸泡，静置过夜。将静置过夜的栽培料浸取液用3层滤网过滤，将滤液置于离心管中于4 ℃下9 000 r/min离心5 min，取上清液即为粗酶液。

1.2.7 酶活的测定

取两支试管，一支加入3 mL蒸馏水，一支加入1 mL粗酶液、2 mL过氧化氢，加完后随即计时，将反应液迅速加入石英比色杯中，在420 nm处每30 s记录一次，测定3 min之内吸光值的变化量，以每分钟吸光值减小0.1为一个酶活力单位[10-12]。

表1 栽培料培养基配比

取5支试管分别加入4 mL CMC，50 ℃水浴3 min，取出后加入稀释50倍的粗酶液1 mL。继续置于50 ℃水浴30 min后取出立即加入5 mL DNS，沸水浴5 min。待试管冷却至室温后测定530 nm处紫外吸收值，重复多次实验，计算每组纤维素酶活力单位数值[13-16]。

2 结果与讨论

2.1 食用菌生长情况

由图1可知，在相同的生长条件下，菌丝随着海藻渣添加量的增加生长速率先增加后减小，由此可以说明适量的海藻渣可以缩短菌丝长满玻璃瓶的时间，促进菌丝的生长。从图2可以看出菌丝洁白、浓密、粗壮且整齐，长势优良。海藻渣比例不同，对菌丝生长的影响也不相同。总体来看，适量的海藻渣有助于菌丝的生长，这可能是因为海藻渣中含有的营养物质适合菌丝生长，当海藻渣量较多时，由于海藻渣容易结块使得栽培料通气性差，不适宜菌丝的生长。

图1 菌丝生长图

图2 出菇过程图

2.2 多糖提取工艺优化结果

2.2.1 响应面分析

如表2所示，通过实验因素水平的设置及实验的验证，采用响应面分析法即非线性拟合方法，确定出多糖提取工艺为：提取时间3 h，水浴温度为60 ℃，固液比为1∶25，该模型预测指导性很强，可靠性强。

表2 实验因素水平表

2.2.2 不同比例栽培料对平菇多糖含量的影响

由表3可知，当海藻渣、棉籽壳比例为5∶5时，平菇子实体多糖产率最高。同时，平菇子实体多糖的产率随着海藻渣添加量的增加先增大后减小。可能是随着海藻渣的添加，粗纤维含量升高促进了纤维素酶活性的提高，加速了纤维素的分解，促进子实体的吸收。但当海藻渣过多时，海藻渣容易结块，不利于海藻渣内纤维素的分解及子实体的吸收。

表3 多糖产量

2.2.3 不同比例栽培料对平菇酶活的影响

如图3多组重复检测数据结果显示，当海藻渣、棉籽壳比例为7∶3时，平菇菌丝体内过氧化氢酶活及纤维素酶活性最高，且与传统栽培料栽培的平菇菌丝体内酶活性相近。此外，随着海藻渣加入量的增多，菌丝体内纤维素酶活性呈现上升趋势，该现象与菌丝体中过氧化氢酶活性变化相符。可能是由于海藻渣内富含的粗纤维没有棉籽壳中的含量多，所以当海藻渣、棉籽壳为1∶9时纤维素酶活性较低，然而随着海藻渣添加，体系内纤维素不断增多，促进了纤维素酶活性的提高。

图3 过氧化氢酶和纤维素酶活性检测结果

3 结论

当海藻渣、棉籽壳比例为5∶5时，平菇菌丝蔓延速度最快，且平菇子实体多糖含量高达14.84%，适量海藻渣的加入对平菇菌丝发育、子实体形成过程具有促进作用；当海藻渣、棉籽壳比例为7∶3时，平菇菌丝中过氧化氢酶及纤维素酶活性最高，且随着海藻渣量的增加，两种酶活均呈现出上升趋势，但酶活性与多糖产量之间没有协同关系，说明过氧化氢酶及纤维素酶不是平菇产多糖的主要酶类；实验只测了2种特殊的胞外酶，关于平菇多糖产量是否与其它胞外酶有关以及具体的作用机制有待进一步研究。