高效液相色谱指纹图谱分析钴60辐照前后龙胆和秦艽成分变化

邓超

（湖南省核农学与航天育种研究所，湖南长沙 410125）

秦艽为龙胆科龙胆属植物，同属4个种，能够作为秦艽药材使用。秦艽分布在青海省、西藏等地区，藏医使用广泛。随着《中国药典》对中药制剂中微生物限度要求的不断提高，中药制剂的灭菌方式备受重视，尤其是含有生物原粉的中药制剂。常见的重要灭菌方式包括干热、湿热、滤过、辐射等灭菌方法。相关规定表示，使用辐射方法灭菌中药制剂前后，要使用指纹图谱等对药品成分种类或者含量变化情况进行充分地展示[1]。因此，本文采用高效液相色谱指纹图谱分析龙胆与秦艽在钴60辐照前后的成分变化进行分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国Agilen公司），主要包括自动进样器、真空脱气机、四元泵、检测器；德国Binder公司生产S120型超声清洗机；德国Binder公司生产ED53型干燥箱；山东新华医疗器械股份有限公司生产全自动台式蒸汽灭菌器；Thermo公司生产IGS180通用型微生物培养箱；德国Binder公司生产DI115型培养箱；日本三洋公司生产MIR-254型低温培养箱；WTBbinder公司生产BD240型生物培养箱。

龙胆苦苷（批号：190617-190819，含量96%）、当药苷（批号：190619-190825，含量93%）、马钱苷酸（批号：190612-190816，含量97%）、獐芽菜苦苷（批号：190620-190824，含量80%）。

三批龙胆药材（批号190620、190712、190816）在云南购买，通过鉴定为坚龙胆；三批秦艽药材（批号190620、190615、190625）通过中一药业在甘肃采购，通过鉴定为亲近。

色谱纯甲醇（液相色谱用）、分析纯甲醇（提取用），其余药品均为分析纯[2]，超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 辐照灭菌

在湖南省核农学与航天育种研究所辐照中心使用动态方式辐照处理龙胆和秦艽样品。钴源装载量为80万Ci，辐射过程中在样品包装盒中采用重铬酸钾（银）-高氯酸剂量计进行防治，确保辐照剂量的精准。第1次辐照剂量为3 kGy、6 kGy、8 kGy、10 kGy、25kGy，通过 3 kGy、6 kGy、8 kGy、10kGy辐照的样品进行第2次剂量为10kGy的辐照，将其作为（3+10） kGy、（6+10） kGy、（8+10） kGy、（10+10） kGy的辐照剂量。

1.2.2 样品提取

称取0.5 g过4号筛（65目）的秦艽或龙胆样品粉末，溶于20.00 mL甲醇（50%）溶液中，超声提取30 min后摇匀并通过0.45 μm滤膜，得到提取液。超声前后要称量溶液质量，并通过补充50%甲醇溶液保持恒重。

1.2.3 色谱条件

色谱柱为Kromasil G18 5 μm分析柱；流动相为甲醇（A）和0.04%磷酸水溶液（B），按照10∶90、20∶80、30∶70、35∶65的程序进行梯度洗脱；流速设置为1.00 mL/min；进样量为4 μL；紫外检测波长设置为222 nm，柱温设置为30 ℃，采样时间为70 min[3]。

1.2.4 方法学考察

（1）精密度试验

精密吸取龙胆苦苷、当药苷、獐芽菜苦苷、马钱苷酸标准储备液20 μL，连续进样6次。

（2）稳定性试验

将“1.2.2”中获得的提取液分别在放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h后进样20 μL，测定峰面积，并计算RSD值。

（3）重复性

对各提取液进行3次进样，制备供试品溶液，记录指纹图谱，测定峰面积，计算平均值[4]。

1.2.5 成分变化百分率计算

成分变化百分率采用公式（1）计算。

公式中的Ai指的是第i个剂量中某峰面积，A0指的是未辐照样品中某峰的峰面积，Wi指的是i个剂量供试品称样量，W0指的是未辐照样品称样量。将成分变化百分率作为纵坐标，辐照剂量作横坐标，对比指纹图谱各峰变化的情况。

1.3 方法学试验结果

通过上述稳定性试验、精密度试验和重复性试验分析，表明该试验方法精密度、重复性良好，供试品溶液在48 h之内稳定。

3 结果分析

3.1 成分变化

图1和图2为龙胆、秦艽3批样品在辐照剂量中的成分和未辐照样品对比情况。可以看出，龙胆辐照之后峰1含量提高，25kGy辐照之后3批样品峰1含量分别为113%、127%和127%。峰7通过辐照之后含量在不断降低，10kGy辐照之后3批样品龙胆苦苷含量为未辐照样品的65%、59%、56%，25kGy辐照之后龙胆苦苷含量是未辐照样品的39%、45%、38%，其他峰没有明显改变。

秦艽辐照之后峰8（龙胆苦苷）含量降低，10 kGy辐照之后3批样品龙胆苦苷含量为未辐照样品的74%、73%和66%；25kGy辐照后龙胆苦苷含量为未辐照样品的65%、58%、49%。峰7含量也不断降低，通过25kGy辐照后3批样品是未辐照样品的83%、77%、69%。峰1含量不断增加，变化并不明显，其他峰没有改变[5]。

图1 3批龙胆样品在不同辐照剂量下的成分和未辐照样品对比情况

图2 3批秦艽样品在不同辐照剂量下的成分和未辐照样品对比情况

3.2 相似度分析

使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》分析辐照前后色谱图，各批样品将同批未辐照样品作为对照，对其他辐照剂量中色谱图相似度进行计算。结果表明，辐照之后的秦艽和龙胆样品与同批次辐照之前样品色谱图的相似度大于0.95。图3为秦艽样品的聚类图。因为部分的峰面积增加或者降低，没有峰个数缺失或者增加，因此辐照之后样品指纹图谱和辐照前的样品具有较高的相似度，在辐照剂量不断增加中，相似度也在不断的降低。

3.3 主要已知成分定量结果

使用外标法对已知4个成分定量。表1为没有辐照和经25kGy剂量辐照的3批龙胆与秦艽样品中4个成分的含量。可以看出，辐照之后龙胆苦苷含量明显降低，其他3个成分含量变化不大或有少量减少，规律和3.1相同，也与《中国药典》中的结果相同[6]。

图3 秦艽样品的聚类图

表1 没有辐照和经25kGy剂量辐照的龙胆和秦艽中4个成分含量的对比

4 结论

创建指纹图谱方法能够满足秦艽和龙胆辐照前后成分含量改变的研究需求。研究结果表明，秦艽和龙胆中龙胆苦苷的含量随着辐照剂量的增加而降低，与其他研究人员研究结果一致；龙胆中未知色谱峰（峰1）在辐照之后含量不断增加，秦艽中獐芽菜苦苷含量不断降低，未在其他研究中发现相似变化。