透明质酸/壳聚糖双层修饰的介孔生物活性玻璃的制备与性能研究

仇可新

（上海双申医疗器械股份有限公司，上海 201707）

在骨修复领域，骨组织工程支架近年来向着生物活性支架方向发展，这样不仅在结构上能够支撑细胞的粘附，还能够在组成上提供生物活性因子来促进骨的再生[1-2]。具体地，一方面是支架结构的限制，即支架中心的营养供应和细胞活力经常受到严重阻碍，这主要是因为细胞生存所需的营养和氧气的扩散距离在150～200 μm[3]，因此可以通过改变支架结构来解决这个问题，制备大孔结构的生物支架，对细胞的生长具有促进作用[4]。另一方面，研究表明在支架表面能够形成小于5 mm的组织层，这会导致支架中心的细胞密度降低，而且容易产生细胞坏死[5]。因此，为了解决这个问题，在支架上负载骨形态发生蛋白等生物活性因子，能够刺激细胞的分化和组织的生长[6-7]。

近年来，介孔生物活性玻璃（MBG）在骨组织工程领域已经引起了广泛的关注[8-9]。与无介孔结构的生物活性玻璃（BG）相比，MBG具有不同的介孔结构和生物活性，在结构上具有更高的比表面积和更大的容积，不仅能够传输蛋白或药物分子，增强体外的生物活性，而且可以缩短降解时间[10]，在骨组织工程和药物传输方面具有巨大的应用前景。

然而，MBG负载生物活性因子容易发生泄漏和浪费问题，将MBG的孔道进行包裹以使生物活性因子缓释发生作用，对MBG支架的生物活性和生物活性因子的利用率具有促进作用[11]。因此，采用透明质酸（HA）和壳聚糖（CS）双层修饰MBG，制备复合支架MBG-HA/CS，选择地塞米松（DEX）进行负载，研究其缓释效果和生物相容性。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

P123（EO20-PO70-EO20，Mn -5800）、聚 氨酯海绵、壳聚糖（CS，Mw 50000-190000 Da）、透明质酸（HA，Mw 500000 Da）、正硅酸乙酯（TEOS，98%）、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷（APTES，98%）、磷酸三乙酯（TEP，99.8%）和地塞米松（DEX）购于美国Sigma-Aldrich公司。盐酸（HCl，分析纯）、硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O, ≥99.0%）、1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC, Mw 191.70）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS, Mw 115.09）和其它化学试剂采购于国药集团。FITC标记的鬼笔环肽溶液购买于碧云天生物技术有限公司。

扫描电子显微镜（SEM，日本Hitachi），透射电子显微镜（TEM，日本Hitachi），X射线多晶衍射仪（XRD，日本Rigaku），热重分析仪（TG，Germany），激光共聚焦显微镜(CLSM，德国Carl Zeiss LSM 700)。

1.2 MBG的制备和修饰

以聚合物P123（EO20-PO70-EO20）和聚氨酯海绵作为共模板剂制备具有介孔结构的MBG多孔支架[12]。P123用于制造支架的介孔结构（介孔尺寸为几个纳米），而聚氨酯海绵制造支架的的大孔结构（大孔径为几百微米）。将12 g P123、20.1 g TEOS、4.2 g Ca(NO3)2·4H2O、2.19 g TEP和3 g HCl（0.5 mol/L）溶于180 g乙醇中，室温搅拌24 h。然后，用蒸馏水将聚氨酯海绵清洗干净，烘干后备用。将聚氨酯海绵放入上述混合溶液中完全浸泡10 min，然后转移到培养皿中，在室温下晾干，此过程重复3次。待样品完全干燥后，置于650 ℃的马弗炉中煅烧5 h，最后得到具有介孔结构的MBG多孔支架材料。

随后，MBG多孔支架进行氨基化处理[13]。将1 g MBG放入含有1 mL APTES的无水乙醇中浸泡24 h。取出后用无水乙醇冲洗3次，除去多余的APTES，得到氨基修饰的MBG支架（记为MBG-NH2）。

MBG-NH2支架进行HA和CS修饰。称取0.2 g EDC和0.37 g NHS溶于20 mL去离子水中，称取113 mg HA溶于60 mL去离子水中；然后将两种溶液混合，使用三乙胺溶液调节溶液pH至9.0。将1 g MBG-NH2放入上述混合溶液中，保持38 ℃条件下搅拌过夜，最后用去离子水清洗样品[14]。使用质量分数为1%的乙酸溶液配制2 mg/mL的壳聚糖溶液，将MBG-HA支架置于上述溶液中，浸泡1 h，然后用去离子水冲洗并真空干燥，最后得到透明质酸和壳聚糖修饰的MBG支架（记为MBG-HA/CS）[15]。

1.3 支架的表征和性能测试

通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察MBG支架的表面形貌和内部结构；使用X射线多晶衍射仪对MBG支架的物相进行分析；通过热重分析仪对MBG-HA/CS的物料变化进一步分析。

1.4 DEX的负载和释放

DEX为合成糖皮质激素，被广泛用于骨组织工程中，研究表明DEX能够诱导骨细胞的分化和骨组织形成[16-17]，因此选用DEX用于药物释放的研究。0.1 g MBG-HA/CS支架材料放入5 mL乙醇溶液中，加入5 mg DEX[18]。在室温下，避光搅拌12 h，再放入真空干燥箱内促使乙醇溶液的蒸发和药物的吸附。随后，将载药的支架材料（DEX@MBG-HA/CS）放入磷酸缓冲液（PBS）中清洗数次，除去样品表面的药物。收集所有的清洗液，通过紫外-可见分光光度计在242 nm下进行吸光度的测量，借助DEX的标准曲线计算DEX@MBG-HA/CS支架中DEX的装载量。经计算，DEX@MBG-HA/CS中DEX的装载量为2.28 mg/g。

将DEX@MBG-HA/CS浸泡在5 mL PBS（pH 7.4）中，保持在37 ℃条件下。在每个设定的时间点，取出缓释溶液并进行收集，然后加入同体积的新鲜PBS溶液。通过紫外-可见分光光度计测量收集的缓释液的吸光度，分析计算DEX的释放量，最终得到每个时间点DEX累计释放量并绘制释放曲线。每个时间点设置3个平行样。

1.5 细胞相容性研究

所有的支架样品经环氧乙烷灭菌处理。分别将无菌的MBG和DEX@MBG-HA/CS支架置于24孔培养板内，并用无菌钢环压住，然后以5×104细胞/孔的密度接种小鼠MC3T3-E成骨细胞。将其置于恒温细胞培养箱中培养1 d、3 d和5 d，期间每2 d更换一次新鲜培养基。待到预定的时间点，将培养基移除，用4%多聚甲醛固定细胞30 min。用PBS冲洗2遍每个样品孔，先用0.1%曲拉通X-100溶液进行通透5 min，再用1% BSA溶液处理20 min。用PBS洗净后，加入FITC标记的鬼笔环肽溶液（165 nmol/L）对细胞进行染色30 min。最后，样品经PBS洗后用激光共聚焦显微镜（CLSM）进行观察并拍摄照片。

2 结果

2.1 扫描电镜和透射电镜观察

由SEM照片（图1A、B和C）可以看出，MBG支架呈现明显的多孔结构，孔与孔之间具有高度连通性，孔的直径为100～300 μm。由TEM照片（图1D）可以清晰看到MBG支架介孔孔道结构，孔道直径约为3 nm，并且均一有序。因此，MBG支架的大孔和多孔结构有利于细胞所需的营养物质输送，而其介孔结构可以用于药物等生物活性小分子的运输[19]。

2.2 X射线衍射分析

XRD图谱（图2）显示MBG支架没有明显的晶体特征峰，在2θ=23°中心处有一个宽峰，表明制备的MBG支架是无定型的[12，20]。

图1 MBG支架的SEM照片和TEM照片

图2 MBG支架的XRD图谱

2.3 MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS的热力学性能分析

通过热重分析法分析MBG、MBG-HA和MBGHA/CS的热力学性能。由图3可以看出，在100 ℃之前，MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS的热量均有所降低，这主要是水分蒸发引起的。随后主要是残留的模板剂、包裹的HA和CS的分解，导致样品质量的下降。最后MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS支架的残留量分别为90.73%、88.14%和87.08%。该结果表明MBG上HA和CS的成功包裹。

2.4 药物释放曲线

由图4的DEX释放曲线可以看出，释放主要表现为两个阶段：DEX在开始7 d以较快的速率进行释放，在随后的21 d表现为稳定长期的释放过程。这可能是由于DEX负载于MBG-HA/CS的孔道和HA/CS的包裹层内，当样品置于PBS缓释液中，HA/CS包裹层内的DEX快速释放到溶液中；随后，MBG-HA/CS孔道内的药物逐渐释放出来。在28 d时，DEX@MBG-HA/CS支架的DEX累计释放量为75%，表明DEX从DEX@MBG-HA/CS支架中释放呈现较好的缓释效果。

图3 MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS的TGA曲线

图4 DEX释放曲线

2.5 细胞相容性研究

将成骨细胞MC3T3-E1接种到MBG和DEX@MBG-HA/CS支架上，培养1 d、3 d和5 d后，对细胞质进行染色后通过激光共聚焦显微镜（CLSM）进行观察。由图5可以看出细胞能够在MBG和DEX@MBG-HA/CS支架上粘附和生长，随着时间的延长，细胞的尺寸开始慢慢变大，由圆点形状逐渐变成海星形状。尤其在DEX@MBG-HA/CS支架上，相比与MBG支架上，成骨细胞伸展良好，出现更多丝状伪足，粘附在支架上，这说明释放的DEX能够促进细胞的粘附和生长。

3 结论

本文制得的MBG支架具有孔径为100～300 μm相互连通的大孔结构和孔道大约为3 nm的介孔结构，并通过透明质酸和壳聚糖双层修饰后负载地塞米松（DEX），成功制得复合载药支架（DEX@MBGHA/CS）。DEX的释放行为表现为开始7 d快速释放，随后21 d长期缓慢释放，起到一定的缓释作用。成骨细胞在DEX@MBG-HA/CS培养后，细胞粘附和生长良好。生物活性玻璃经修饰后表现出的优异载药性能，应用到骨修复中具有良好的前景。

图5 细胞激光共聚焦显微照片（200倍）