水产品特定腐败菌应用价值及分析技术研究进展

左迪 马长安 李博

摘 要：特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）是影响水产品腐败的主要因素之一。本文分析SSO在水产品货架期预测与延长中的实际应用价值，总结水产品SSO多种分析技术，如细菌基因组重复序列聚合酶链式反应、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性和高通量测序等，为水产品SSO分析技术的研发提供理论参考，也为水产品SSO的深入研究提供理论依据。

关键词：水产品;特定腐败菌;货架期预测;应用价值;分析技术

A Review of Specific Spoilage Organisms in Aquatic Products： Application Value and Analytical Technologies

ZUO Di， MA Changan， LI Bo*

（School of Health and Social Care， Shanghai Urban Construction Vocational College， Shanghai 201415， China）

Abstract： The specific spoilage organism （SSO） is one of the most important causes of aquatic product spoilage. Here， we review the potential value of SSO in predicting and more broadly extending the shelf life of aquatic products and we summarize various technologies for the analysis of SSO in aquatic products such as repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction （Rep-PCR）， denaturing gradient gel electrophoresis technology （DGGE）， restriction fragment length polymorphism technology （RFLP） and high-throughput sequencing. We hope that this review will provide a theoretical basis for the development of new technologies to analyze SSO in aquatic products for further research.

Keywords： aquatic products; specific spoilage organisms; shelf life prediction; application value; analytical technologies

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240

中圖分类号：TS254.4                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）12-0094-05

引文格式：

左迪， 马长安， 李博. 水产品特定腐败菌应用价值及分析技术研究进展[J]. 肉类研究， 2020， 34（12）： 94-98. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240.    http：//www.rlyj.net.cn

ZUO Di， MA Changan， LI Bo. A review of specific spoilage organisms in aquatic products： application value and analytical technologies[J]. Meat Research， 2020， 34（12）： 94-98. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240.    http：//www.rlyj.net.cn

每年，全世界因微生物污染而造成的食物腐败率高达25%，腐败微生物的研究受到学者们的广泛关注[1]。水产品味道鲜美，营养丰富，是重要的优质动物蛋白源，深受消费者青睐。水产品因肌肉等组织中水分、不饱和脂肪酸和可溶性蛋白的含量很高，在捕捞至加工销售过程中易发生腐败变质现象[2]，微生物是引起水产品腐败变质的主要原因，因此，控制和分析导致水产品腐败的微生物种类，延长水产品的货架期具有重要的实际意义和经济价值[3]。本文综述水产品的腐败机理，对引起腐败的特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）进行分析，同时对SSO的分析方法进行比较，旨在为抑制SSO新技术的开发提供应用参考，也为水产品贮藏和货架期的延长提供指导。

1 水产品SSO

水产品腐败主要是指某些微生物在生长、代谢过程中会产生胺、硫化物、醛、酮、酯、有机酸等物质，同时伴有不良气体和滋味，使得水产品在感官上不被接受。而在水产品腐败过程中占有优势的这些微生物被称为SSO。SSO在水产品贮藏早期的数量和群落占比都非常小，但随着贮藏时间延长，SSO的数量快速增长，菌落占比明显上升。

水产品中的SSO种类众多，其分布和数量受到水产品的种类、产地、季节、加工及贮藏环境等因素影响。目前，已知的水产品SSO主要有鲜鱼中的弧菌科（Vibrionaceac）、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）;鱼、贝和甲壳动物中的希瓦氏菌（Shewanella）、磷发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）、乳酸菌（Lactobacillus）、热杀索丝菌（Brochothothrix thermosphacta）、芽孢杆菌（Bacillus）和梭状芽孢杆菌（Clostridium prazmowski）[4-7]等。

2 SSO的应用

2.1 SSO生长模型及水产品货架期预测

细菌菌落总数是评判水产品新鲜度的重要指标，而水产品因贮藏条件的差异而表现出不同的腐败特性，因此依据细菌菌落总数评判水产品新鲜度并不准确[8]。在水产品贮藏期间，SSO的生长和繁殖速率明显高于其他细菌，且随着贮藏时间的延长，SSO在菌落总数中的比例也不断增加，SSO的代谢产物有明显的异味及腐臭味，感官刺激强烈，因此SSO的数量或代谢产物的含量可以作为水产品新鲜度的评定指标，同时SSO的数量和生长模型可预测水产品剩余货架期。欧盟“鱼类鲜度评定”研究中，确定了产品剩余货架期与腐败希瓦氏菌、磷发光杆菌、热杀索丝菌、乳酸菌的数量直接相关，且远大于总活菌数与鱼类剩余货架期的相关性[9]。因此，建立腐败希瓦氏菌、磷发光杆菌和假单胞菌属的生长动态模型，并应用于有氧、真空、气调包装冷链水产品剩余货架期的预测[10-11]。

水产品货架期与SSO的数量密切相关，建立SSO生长预测模型有助于水产品质量的保证和货架期的预测。早期的概率模型在水产品加工贮藏中应用广泛，但概率模型属于典型的经验模型，不能明确显示微生物的实际生长情况，因此早期的概率模型被动态模型取代。根据模型中变量的不同，可分为初级模型、次级模型和三级模型[12]。

初级模型反映在特定条件下微生物随时间变化而产生的差异，一般包含修正的Gompertz模型、Baranyi模型、Logistic模型、Richards模型、Stannard模型及Schnute模型等，其中修正的Gompertz、Baranyi、Logistic 3 种模型是初级模型中应用较为广泛的生长预测模型。修正的Gompertz模型能够绘制生长延滞期、快速生长期等微生物生长发育不同时期的S型曲线，预测效果较好;而Baranyi与Logistic模型最大的区别在于Baranyi模型中添加了迟滞期参数[13];鱼类气调包装中的SSO磷发光杆菌动力学采用Logistic模型，结果显示，预测货架期与实测货架期相比相对误差较小[14]。

次级模型反映环境因素，如温度、pH值、水分活度、气体组成等对微生物生长的影响，次级模型多涉及响应面方程、平方根方程和Arrhennius方程等，其中响应面方程可以与修正的Gompertz模型联合使用;Arrhennius方程显示微生物与温度的相互关系，但此模型并不适用于冷藏食品[15]。建立不同温度条件下假单胞菌生长的平方根模型与Arrhenius模型，结果显示，平方根模型对于微生物最大比生长速率与生长延滞期的预测偏差小于Arrhenius模型[16]。

三级模型也称之为专家模型，是在初级模型和次级模型基础上建立的共享软件，也是能够计算不同环境下微生物行为的专门系统，Combase数据库是全球范围内涉及食品微生物模型的最大数据库，模拟微生物具体生长环境存在一些局限性，所以专家模型还有待于进一步的研发与完善[17]。

2.2 SSO的抑制及水产品货架期的延长

SSO是引起水产品腐败的主要因素，根据SSO的生物学特性抑制SSO的生长，能够延长水产品的货架期。常采用低温贮藏、不同包装（如空气包装、真空包装、气调包装等）、保鲜处理3 种方法抑制SSO生长。

贮藏温度影响微生物的生长，进而影响水产品的腐败，因此水产品主要以低温贮藏为主，低温贮藏能在一定程度上抑制SSO的生长，延长水产品的货架期;鲈鱼（Lateolabrax japonicus）和草鱼（Ctenopharyngodon idellus）在微冻（-2 ℃）状态下，SSO的生长抑制率明显高于冷藏（4 ℃）状态，微冻贮藏还能缓解鲈鱼品质的劣变[18];冷藏条件下的气调包装罗非鱼片，货架期可延长至18 d[19]。

水产品主要通过袋装、真空包装、气调包装等形式进行包装，SSO的种类随着水产品包装方式的不同而产生明显差异，因此可以选用不同的包装方式抑制SSO的生长。在扇贝的贮藏中，产品处理后采用真空包装方式，其残存的SSO（梭状芽孢杆菌）受到抑制，且产品的水分含量仍保持在较高的水平，在保证水产品安全的基础上又保证其食用品质[20];地中海旗鱼（Tetrapturus）采用有氧托盘包装，其SSO为假单胞菌和腐败希瓦氏菌，更换为真空包装，SSO变为乳酸菌，而变更为气调包装后，SSO则为磷发光杆菌，不同包装方式旗鱼的SSO种类明显不同，其中气调包装旗鱼货架期最长，而托盘包装状态下，旗鱼的腐败率最高[21]。

水产品中常采用物理保鲜、化学保鲜和生物保鲜等方法控制SSO，延长货架期。采用壳聚糖溶液（2 g壳聚糖加入98 mL体积分数1%醋酸溶液混合后配制成）和石榴皮提取物（体积比1∶2）处理虹鳟（Oncorhynchus mykiss）后，-18 ℃条件下虹鳟的保藏期长达6 个月[22];混合保鲜剂聚己二酸丁二酯和牛至精油组成的生物薄膜用于鱼片貯藏后，可有效减少鱼片中嗜冷菌数量[23];生物保鲜剂处理青占鱼后，其货架期延长4～5 d[24];贮藏带鱼（Trichiurus haumela）中添加茶多酚（生物抗氧化剂）和Nisin（生物抗菌剂）后，带鱼货架期有效延长6 d[25-26]。

3 SSO分析技术的研究现状

水产品中的SSO与产品种类有关，且存在很大差异。传统的SSO分析方法包括镜检、平板培养、生化反应、产气实验等，但这些方法周期较长，灵敏度和准确度较低[27]，且并非所有的食品微生物都可进行培养，因此，传统的培养鉴定分析水产品SSO的方法存在一定局限性和制约性。随着分子生物学技术的发展，分子诊断技术多用于SSO分析，其中聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）广泛应用于食品微生物领域[28]。水产品中SSO的分析技术包括细菌基因组重复序列PCR（repetitive extra-genic palindromic PCR，Rep-PCR）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和高通量测序技术等。

3.1 Rep-PCR技术

Rep-PCR技术以细菌DNA中重复的回文序列为引物，对细菌基因组进行扩增后得到指纹图谱，揭示基因组间的差别，在细菌分析和检测方面具有很好的简捷性和实用性[29]。DiversiLab（DVL）系统是以Rep-PCR技术为原理的自动化分子分型系统。采用DVL系统对食品中的21 株副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）进行分子分型，分析各菌株之间的相关性，并将分型结果与脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技术结果相比较，发现DVL系统中副溶血性弧菌分群能力和分辨率与PFGE分型结果相似[30]，但其简便性和实用性远高于PFGE技术，同时Rep-PCR法也明显优于核糖体分型方法[31-32];采用DVL系统和PFGE 2 种方法分别对2 株阪崎肠杆菌属（Cronocacter）菌株丙二酸盐克罗诺杆菌（Cronocacter malonatius）和都柏林克罗诺杆菌（Cronocacter dublinensis）进行分型比较，结果表明，Rep-PCR对菌株分类和种群分类的分析效果明显优于PFGE[33];采用Rep-PCR技术分析150 份水产品中的副溶血性弧菌分离株，发现Rep-PCR分析技术不仅可以区分不同分离株，还可以区分不同病毒型的分离株[34]。

3.2 DGGE技术

DGGE技术是利用DNA结构的特异性和稳定性，结合凝胶电泳测定细菌16S rDNA片段扩增产物，分析不同条件下不同样品中微生物的群落组成变化和数量变化，判断样品中的优势菌[35]。与其他分析技术相比，DGGE技术在微生物群落多样性和种群差异性检测方面具有显著优势，近年来DGGE技术也越来越多地应用于水产品SSO的研究[36-37]。大西洋庸鲽（Hippoglossus hippoglossus）比其他大多数白鱼物种具有更长的保质期，对其SSO的研究具有重要的实际应用价值，研究结果也能为其他鱼类保质期的延长提供参考[38]。采用DGGE技术分析海水网箱养殖青石斑鱼（Epinephelus awoara）体表和鳃组织中的黏附菌群，结果表明，青石斑鱼体表黏附菌群组成结构较为复杂，无明显的优势菌群，而鳃组织中的黏附菌群组成结构较为简单，存在明显的优势菌群，且体表与鳃组织中的黏附菌群结构存在明显差异，而个体间体表黏附菌群结构相似度较高，DGGE技术能够直观分析养殖水体中的微生物多样性，获得环境微生物群落中的优势菌群[39]。

3.3 RFLP技术

RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，PCR技术与RFLP分析技术结合在一起可以得到简单有效的分子图谱。核糖体RNA是特定的目的基因，其中以16S rDNA PCR与RFLP技术最为成熟。利用RFLP技术分析冷藏条件下罗非鱼下脚料酶解液中的SSO类型，RELP分析显示，冷藏条件下存在3 种腐败菌，其中分型Ⅰ有11 种，分型Ⅱ有4 种，分型Ⅲ有3 种，通过序列比对及系统进化树分析，分型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别与假单胞菌、气单胞菌、芽孢杆菌16S rDNA相似性极高，表明冷藏条件下罗非鱼下脚料酶解液中SSO为假单胞菌[40]。

以鲈鱼为研究对象，采用末端限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）

技术分析冷藏条件下鲈鱼菌群的变化，推断假单胞菌属和环丝菌属（Pseudomonas sp.）是造成鲈鱼货架期缩短的优势腐败菌[41]。RFLP技术能够简单、快速确定水产品中的SSO，具有较好的应用前景。

3.4 高通量测序技术

高通量测序技术是DNA测序发展里程碑，主要包括以454（GS-FLX）、Solexa Genome Analyzer和SOLiD为代表的第2代高通量测序技术，以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT为代表的单分子测序技术，以及Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine（PGM）测序技术等[42]。高通量测序技术具有测序精准、产出量高、成本低廉等诸多优点，目前已被广泛应用于水产品SSO的研究中[43-44]。

利用高通量测序技术分析不同冷藏时间（0、4、8 d）牡蛎中SSO的变化，结果表明，冷藏初期牡蛎中SSO为弧菌属、希瓦氏菌属和交替假单胞菌属，随着冷藏时间的延长，牡蛎SSO中弧菌属所占比例迅速下降，SSO为希瓦氏菌属和交替假单胞菌属[45]。应用高通量测序方法研究克氏原螯虾（Procambarus clarkii）在4 ℃冷藏期間微生物多样性及SSO种类，结果显示，希瓦氏菌、肉食杆菌属（Carnobacterium sp.）、环丝菌属、嗜冷菌属（Psychrobacter sp.）、漫游球菌属（Vagococcus sp.）、

不动杆菌属（Acinetobacter sp.）等在腐败末期时的物种相对丰度为90.57%，确定克氏原螯虾的优势腐败菌为希瓦氏菌、肉食杆菌等[46]。采用高通量测序技术分析虾夷扇贝柱在不同贮藏温度（4、15、25 ℃）下SSO的变化，结果显示，4 ℃贮藏条件下虾夷扇贝柱中SSO为发光杆菌属（Photobacterium）、别弧菌属（Aliivibrio）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），15 ℃贮藏条件下虾夷扇贝柱中SSO为发光杆菌属和别弧菌属，而25 ℃贮藏条件下虾夷扇贝柱中SSO为发光杆菌属、别弧菌属、梭杆菌属（Fusobacterium）和乳酸菌属（Lactobacillus），隨着贮藏温度的变化，SSO种类和所占比例均有明显改变[47]，这也为水产品的保鲜和货架期的延长提供了参考。为揭示超高压处理对牡蛎腐败菌群的影响，采用高通量测序技术分析生鲜和腐败牡蛎的细菌群落结构，结果表明，新鲜牡蛎中SSO以弧菌属、希瓦氏菌属和交替假单胞菌属为主，而腐败后牡蛎中的SSO以交替假单胞菌属和希瓦氏菌属为主，超高压处理改变了牡蛎冷藏过程中SSO的构成，腐败希瓦氏菌经400 MPa及以上压力处理后未检出活菌[48]。

利用高通量测序技术揭示凡纳滨对虾（4±1） ℃贮藏过程中菌群结构的变化，结果表明，贮藏凡纳滨对虾初始菌群以鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）为主;随着冷藏时间的延长，鞘脂杆菌属、金黄杆菌属、寡养单胞菌属的比例迅速降低，系统进化树分析结果表明，交替假单胞菌属、希瓦氏菌属和别弧菌属成为优势菌，高通量测序能够更加全面和准确地显示凡纳滨对虾中菌群的组成、丰度信息及冷藏条件下的SSO[49];高通量测序能够对水产品在不同贮藏环境及不同贮藏时间的优势菌群进行准确分析，同时可以结合微生物动力学等知识，用于货架期预测模型的构建、延长货架期等。

4 结 语

SSO的生长是水产品腐败变质的主要原因，确定SSO在不同贮藏条件下的生长特性，建立SSO生长预测模型，对于了解不同条件下水产品的腐败特性、延长水产品的货架期、保证水产品的质量具有重要意义。水产品SSO及货架期预测模型的开发和优化仍是研究的重点，同时应结合多种分析技术确定SSO，深入探究SSO的腐败机制，研发出更有效的SSO控制新技术。

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