模拟盆栽条件下盐肤木对3种重金属胁迫的耐受性及其富集作用研究

罗劲松，闵运江，陈 玉，闫欠欠，吴唐娟

(1.安徽林业职业技术学院，安徽 合肥 230031；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012)

据有关研究报道，到21世纪初我国受污染耕地面积达2000万公顷，约占我国耕地面积的20%，每年因土壤污染而粮食减产超千万吨[1-2]，给我国造成巨额经济损失。

土壤重金属污染已成为当今全球共同面临的严峻问题。而利用植物修复重金属污染土壤，成为解决这一难题的重要技术手段之一。因植物修复重金属污染土壤效果好、成本低、易于管理等[3-6]，已经成为生态学研究热点之一。

盐肤木(RhuschinensisMill)也称五倍子树，是漆树科盐肤木属分布极其广泛的常见落叶灌木或小乔木[7](P299-300)，可作中药及工业染料的原料等，其果实可榨油[8-10]。该植物喜光，对土壤和气候的适应性强，具有种植成本低、易于大规模种植、抗逆性强，为矿山等污染废弃地的常见先锋植物之一[11-13]。盐肤木对重金属的耐受性和富集能力研究，可为寻找重金属污染土壤修复植物，尤其是超富集植物提供重要借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

植物材料粉碎机；马弗炉(SRTS-6-13型)；原子吸收分光光度计(WFX-110型)；水浴锅；超净工作台；电子秤；分析天平；通风橱；塑料花盆；等。

1.2 材料和试剂

1.2.1 实验材料

盐肤木(RhuschinensisMill)种子：网上选购(由江苏宿迁华丰种业公司提供)。

河沙培养基：取洁净的河沙，过2 mm筛去除大粒石块等杂质，再用流水淘洗至河沙表面水流不再浑浊，再用去离子水洗2～3次，最后置于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌1 h，烘干后冷却备用。

1.2.2 主要试剂

Pb(NO3)2，CdCl2，K2Cr2O7，KMnO4，氯化汞，高氯酸，硝酸，赤霉酸，复合肥，去离子水，等。

1.3 实验方法

1.3.1 盐肤木种子的预处理步骤[14]

取盐肤木种子，用自来水浸种，除去漂浮的不饱满的不健康种子，再用40 ℃左右的无菌水搓洗种子3次。

将洗好的种子置于5 g/L的 KMnO4溶液中浸1 h，自来水冲洗种子表面附着的高锰酸钾。

加入500 mg/L的赤霉素于45 ℃恒温水浴锅中浸泡24 h后洗净，常温无菌水浸泡24 h。

在无菌操作台上，将处理好的种子于已铺有1 cm厚细沙(已灭菌)的带孔塑料托盘中(所有的托盘均用KMnO4溶液擦拭1～2遍)，种子上面盖上湿纱布，纱布上再铺一层湿细沙。

保持细沙湿润状态并放在常温下培养至发芽，胚根伸出种皮2～3 mm时可用于播种至各实验组花盆内的土壤中。

1.3.2 不同浓度梯度的重金属污染土壤的配制

配制含重金属污染土壤的方法：每盆装5 kg灭菌的河沙，分别用Pb(NO3)2，CdCl2，K2Cr2O7等含重金属铅、镉或铬配制含重金属土壤，以重金属纯含量计算的土壤含重金属的量(mg/kg)。即准确称取含3种重金属的试剂，分别溶于2500 mL的水中，均匀拌入沙土内，模拟重金属污染土壤环境。

以不含重金属的2500 mL水拌入沙土内，作为对照组。

分组设置：每种重金属1大组，每大组内分5个梯度浓度和一个空白对照组，如表1，每个浓度梯度设三组平行。

表1 各组重金属含量配置设置表/mg·kg-1

1.3.3 栽培实验

标记花盆，每盆均匀植入20粒已萌发的盐肤木种子于沙土表面，再覆盖约1 cm厚的湿沙土，移至室外培养。常规管理，观察各组种子萌发情况，并定期测量株高。

自播种之日起，第30天进行第一次株高的测量，以后每隔30天定期测量各实验盆中盐肤木苗的株高，计算每组每盆的平均株高。连续测定6次，得出各小组的平均株高增幅。

1.3.4 发芽率的测定

盐肤木种子在含有重金属的土壤中萌发需要一段适应期，以萌发后幼苗出土作为基准，记录发芽种子数。至各组发芽率不再变化为止，计算种子发芽率。

1.3.5 发芽完成时间的测定

每天观察萌发出土后的盐肤木幼苗数，每组以种子萌发出第一株幼苗开始计时，直至不再有新芽产生为止，记录所需发芽时间长短(天数)。

1.3.6 各组培养的盐肤木根、茎和叶中重金属含量的测定

1)材料收集与分类：待植株生长到秋季，将各组盐肤木植株整株挖出，测量其最终株高，再洗净，晾干。将每种重金属的每个浓度组(三盆)按各自根、茎、叶不同器官分别处理样品，各自烘干、称量干重。分别粉碎，装袋密封，置于干燥器中，备用。

2)样品的预处理：精确称取各组样品粉末1.000 g，装入已标记的洁净瓷坩埚中，炭化至无烟，然后放入高温灰化炉内，550 ℃灼烧至灰白色。室温冷却，按国标方法[15-17]中的干法灰化方法处理灰分，过滤，除去不溶性物质，定容至50 mL，即得各组植株的根、茎、叶样品的重金属含量测定液(样液)。

3)火焰原子吸收条件的选择：按照国标方法分别设置铅、镉和铬的测定条件(见表2)

表2 铅、镉、铬的火焰原子吸收工作条件

4)铅标准曲线的绘制：按国标方法制备铅的标准储备液，并分别稀释成梯度浓度为0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L，按上述铅的测定条件，对各梯度浓度标准溶液进行火焰原子吸收吸光度测定，绘制铅浓度(mg/L)对应吸光度的标准曲线。

5)镉和铬标准曲线的绘制：按国标方法分别制备镉和铬的标准储备液，并分别稀释成梯度浓度为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L，按上述镉和铬的测定条件，测定各自的吸光度，分别绘制镉和铬的浓度(mg/L)—吸光度的标准曲线。

1.3.7 样品中重金属富集量(含量)和富集系数的测定

在上述各标准液测定的火焰原子吸收条件下，依次对各样液进行吸光度测定，代入标准曲线的回归方程，计算出各器官中重金属的富集量(即盐肤木各器官中重金属占干重的量，mg/kg)和富集系数。

试样中富集量和富集系数按下式进行计算：

各器官中金属含量的计算结果取各浓度小组中三个平行样同一器官中重金属含量的平均值。

判断是否为超富集植物的最重要标准是：富集系数≥1。即地上器官中重金属含量高于地下根系中重金属含量，为该重金属的超富集植物[6，18-20]，反之则不是。

1.4 分析使用的相关软件

采用SPSS及Microsoft Excel处理数据并作图。

2 结果与分析

2.1 重金属胁迫对盐肤木发芽率、发芽完成时间的影响

用上述方法中记录的每种重金属大组中各浓度组的盐肤木的发芽率及发芽完成时间(天数d)，三个平行的简单平均统计如表3。

由表3可知，各大组的对照组发芽率均达90%左右，而各重金属处理组的情况分别是：Pb2+或Cd2+含量高于50 mg/kg及Cr6+含量高于5 mg/kg的土壤中，盐肤木种子萌发率均低于对照组。但Cd2+含量低于25 mg/kg的各组萌发率与对照组差异不显著。

同时，所有处理组发芽时间跨度均长于对照组；且各重金属大组内都是发芽时间随土壤重金属含量的渐次增高而相应延长。

表3 不同浓度三种重金属胁迫下盐肤木的发芽率(G)及发芽完成时间(T)

注：1.同一金属组内各浓度间比较；G、T分别代表盐肤木的发芽率和发芽完成时间(天数)；2.各组C0- C5表示重金属含量见表1。

由此可见，土壤中重金属铅、镉和铬对盐肤木种子的萌发均有程度不等的抑制作用。

2.2 重金属胁迫对盐肤木苗期生长(株高增幅)的影响

表4 不同浓度三种重金属胁迫下盐肤木平均每株株高总增幅

注：1.同表3注释2；2.同一重金属组比较，字母不同的表示二者在5%水平下，差异显著。

由表4可见，重金属Pb2+、Cd2+和Cr6+对盐肤木幼苗期生长(株高增幅)的影响效果不同，具体表现是：

1)铅组：土壤中铅在50～800 mg/kg内，各处理组平均株高增幅都显著小于对照组；但在50～400 mg/kg范围内，各组平均株高总增幅差异不显著；不过，800 mg/kg时平均株高总增幅比400 mg/kg以下的各组显著减小(p<0.05)。

说明土壤含50 mg/kg以上的重金属铅对盐肤木生长抑制作用显著，尤其是800 mg/kg以上的土壤重金属铅对盐肤木幼苗期生长抑制效果更显著。

2)镉组：土壤中含Cd2+在5～100 mg/kg范围内，各处理组平均株高增幅都显著小于对照组；但在5～50 mg/kg范围内，各组平均株高总增幅差异不显著；不过，75～100 mg/kg时平均株高总增幅比50 mg/kg以下的各组显著减小(p<0.05)。

说明土壤含5 mg/kg以上的重金属镉对盐肤木生长抑制作用亦显著，尤其是75 mg/kg以上的土壤重金属镉对盐肤木幼苗期生长抑制效果更显著(p<0.05)。

3)铬组：土壤中含Cr6+在5～100 mg/kg范围内，各处理组平均株高增幅都显著小于对照组；并且，各处理组株高平均增幅随土壤Cr6+含量增高而降低，且差异显著(p<0.05)。

2.3 不同浓度3种重金属胁迫下盐肤木各器官的重金属富集量和富集系数

2.3.1 铅、镉和铬3种重金属标准液的标准曲线

按表2中火焰原子吸收测定各重金属的条件，分别测定的各重金属标准溶液，绘制标准曲线如图1—图3。

图1 Pb2+的标准工作曲线

图2 Cd2+的标准工作曲线

图3 Cr6+的标准工作曲线

2.3.2 各组样品中3种重金属的富集量和富集系数测定结果

按上述每种重金属标准溶液的火焰原子吸收测定的条件，分别测定的各重金属组样液的每一浓度组的测定值(三盆各自测定值的简单平均值)，计算茎和叶的富集系数，如表5。

由表5可见，盐肤木植株的根茎叶等不同器官对Pb2+、Cd2+和Cr6+的富集量和富集系数既相似，又有所不同，具体特征如下：

1)铅组：土壤含重金属Pb2+在50～800 mg/kg的范围内，各处理组的盐肤木根茎叶等器官中重金属铅的含量(富集量)均高于对照组；且随土壤重金属铅含量的增高而盐肤木根茎叶三种器官中铅的富集量也相应地增高；而且，当土壤中铅含量为800 mg/kg时，盐肤木的根中Pb2+的富集量高达2378.93 mg/kg；且各Pb2+处理组的盐肤木根中铅含量均显著高于对应的土壤中铅的浓度。然而，盐肤木的茎和叶对铅的富集系数均<1。

说明盐肤木对土壤中重金属铅有较强的富力能力，但达不到超富集水平，也就是说，盐肤木不是铅的超富集植物[6]。

2)镉组：土壤含重金属Cd2+在5～100 mg/kg的范围内，各处理组的盐肤木根茎叶等器官中重金属镉的富集量均高于对照组；且随土壤重金属镉含量的增高而盐肤木根茎叶三种器官中镉的富集量也相应地增高。但盐肤木的茎和叶对镉的富集系数也都<1。

说明盐肤木对土壤中重金属镉也有一定的富力能力，但达不到超富集水平，也就是说，盐肤木也不是镉的超富集植物[6]。

3)铬组：土壤含重金属Cr6+在5～100 mg/kg的范围内，各处理组的盐肤木根茎叶等器官中重金属铬的富集量均高于对照组；且随土壤重金属铬含量的增高而盐肤木根茎叶三种器官中铬的富集量也相应地增高；Cr6+含量为100 mg/kg时，盐肤木的根中Cr6+的富集量可达110.62 mg/kg，而盐肤木幼苗的茎中Cr6+的富集量达298.33 mg/kg，均显著高于土壤中Cr6+的含量。同时，Cr6+的各浓度组中，盐肤木的茎对铬的富集系数都>1(为2.06～3.52)，但是其叶对铬的富集系数在各浓度组均<1。

说明盐肤木对土壤中重金属铬具有较强的富力能力，按盐肤木地上器官茎对铬的富集系数来看，达到超富集水平，也就是说，初步可以说盐肤木是重金属铬的超富集植物[6]。

表5 不同浓度三种重金属胁迫对盐肤木根、茎、叶重金属富集的影响

注：表中数据为实验实际测定值，其中个别数值出现偏差，可能是实验偶然误差所致。

盐肤木对Cr6+富集效果很强，富集系数达2.06～3.52，显著大于1，显示盐肤木不仅可以超量吸收Cr6+，而且可以从地下向地上茎部有效输送[13]。

3 讨论

3.1 盐肤木对3种重金属耐性大小的问题

实验进行的前期，在摸索浓度梯度设置的过程中，将3种重金属的浓度都设在0～800 mg/kg范围内，Pb2+组盐肤木发芽率明显高于Cd2+和Cr6+两组。在200 mg/kg以上时，Cd2+和Cr6+两组发芽率不到10%，且出芽幼苗在生长不到5 d，就出现幼苗褪绿，叶脉组织呈酱紫色，茎部萎缩，根部变细发软，根与茎之间部分还出现了黑色灼烧段等受害现象。说明盐肤木对三种重金属耐受性最大的是铅。通过降低浓度梯度，使重金属Cd2+和Cr6+的浓度梯度为0～100 mg/kg。盐肤木对Cd2+的耐受性高于Cr6+。

综上分析，盐肤木对3种重金属的耐受性大小为：铅>镉>铬。在0～800 mg/kg范围内盐肤木对金属铅虽有吸收，但达不到超富集水平。其可能原因是：浓度梯度设置较大，对盐肤木根部造成损伤，其原因可能是Pb2+抑制了根细胞分裂，从而抑制了盐肤木的生长，也抑制了地上器官对Pb2+的吸收[20]。

3.2 盐肤木是否是重金属超富集植物的问题

由以上研究结果可见，在实验设置的Pb2+和Cd2+各浓度组，盐肤木的地上器官茎和叶的富集系数都小于1，说明盐肤木既不是铅的超富集植物，也不是镉的超富集植物。

而重金属Cr6+的各处理组中，盐肤木地上器官茎的富集系数都大于2。表明盐肤木茎对这种重金属铬有超强的富集能力。陈晶等的研究报道，盐肤木在低浓度重金属铬胁迫下其丙二醛、脯氨酸含量增加，SOD活性和CAT活性也随之升高[13]，这一研究结论，可能解释了盐肤木对重金属铬等的耐受性较强的部分原因。

因此，盐肤木植株对重金属铅、镉尤其是铬的富集能力，尤其对盐肤木是否是铬的超富集植物问题，值得进一步深入研究。