PCR荧光和PCR膜杂交检测HPV-DNA的比较研究

董福昌

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病的主要诱因是人类乳头瘤病毒（HPV）感染。有研究显示美国50 岁以上的妇女80%会感染一次乳头瘤病毒感染。不同类别的HPV感染其致病性存在显著差异[1]。早诊断HPV感染有助于宫颈上皮内瘤病变进一步恶化，因此是医学研究的关键[2]。目前国内检测HPV-DNA的方法是PCR-荧光法与PCR-膜杂交法[3]。文章探索PCR-荧光法与 PCR-膜杂交法在检测HPV-DNA中的应用对比研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年8 月-2019 年8 月收集送至本医学检验实验室的208 例标本，患者年龄22～65 岁，平均年龄（38.32 ±5.6）岁，患者均接受HPV和组织学检测。采集受检者的宫颈口鳞、柱状上皮交界处，采用专用脱落细胞采集器进行采集，并进行细胞组织学检测。

1.2 方法 ①PCR-荧光法：取2 uL的待测DNA加入到试剂盒的反应管中，在同一PCR反应中检测宫颈脱落细胞中的13 种高危型HPV-DNA包括：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59、68。反应温度50 ℃，2 min，95 ℃，10 min。循环40个。使用荧光PCR检测仪并且记录荧光标记探针在分子杂交时的荧光能量变化。采用自动记录荧光值变化并转换成DNA模板量，判断检测结果。全程设置HPV阴性对照和临界阳性对照，从而控制质量。②PCR-膜杂交法：采用反向点杂交检测扩增产物和包被有型特异性探针膜杂交结果，再进行定性检测，对21 种HPV基因型：HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68进行分型检测。标本采集，按比例将PCR Mix、Taq酶和DNA模板混匀。扩增温度：95 ℃，9 min，循环40 个。阳性结果显色为清晰可见的蓝紫色圆点。设置阴、阳性对照，从而控制质量。

1.3 细胞学检查 按照细胞组织学诊断分为恶性病变、非典型鳞状上皮细胞增生、鳞状上皮细胞病变，宫颈鳞癌。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，计数资料以[n(%)]的形式表示，采用χ2检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR-荧光法与 PCR-膜杂交法在细胞组织学分组中的检测阳性情况 208 例标本，采用PCR荧光法检测HPV-DNA阳性率（34.62%）低于PCR-膜杂交法检测阳性率（46.63%）；其中细胞组织学诊断的异常细胞154例中PCR-荧光法检测阳性率（14.29%）低于PCR-膜杂交法检测的阳性率（28.57%），差异具有统计学意义（P＜0.05）；54例细胞异常患者的PCR-荧光法和PCR-膜杂交法的检测比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 PCR-荧光法与 PCR-膜杂交法在细胞组织学分组中的检测阳性情况 例(%)

2.2 恶性病变组和细胞异常组的患者采用两种方法检测的情况比较 恶性病变组分别采用PCR-荧光法和PCR-膜杂交法检测阳性率分别为14.29%、28.57%，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞异常组分别采用PCR-荧光法和PCR-膜杂交法检测阳性率分别为92.59%、98.15%，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组患者采用两种方法的检测情况比较 例(%)

3 讨 论

PCR-膜杂交法是通过检测位点是否出现出现信号判断，而信号点的强弱反映定量信息。当PC位点外膜条上各检测位点有信号，还能分辨混合型感染[4]。PCR-荧光法能够实时监测荧光扩增过程，能够进行准确的半定量分析，有助于筛查高危HPV亚型的患者，具有操作简单、快速省时、分析准确、成本低、适用样本类型多等优点，是HPV检测的优选方法[5]。

本文结果显示送至本医学检验实验室的208例标本，采用PCR荧光法检测阳性72 例，阴性136例，阳性率是34.62%，采用PCR-膜杂交法检测阳性97 例，阴性111 例，阳性率是46.63%。说明两种方法检测不同细胞组织学分类中阳性比例不同。通过细胞组织学诊断的异常细胞54 例，比例是25.96%，恶性病变组的患者分别采用PCR-荧光法和PCR-膜杂交法的检测HPV-DNA的阳性率是14.29%、28.57%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。原因是PCR荧光法的检测人群仅限于13 种类型的高危HPV。细胞异常组的患者分别采用PCR-荧光法和PCR-膜杂交法的检测HPVDNA的阳性率是92.59%、98.15%，差异无统计学意义（P＜0.05）。说明HPV感染与宫颈癌的病变具有显著的相关性。

综上所述，PCR-荧光法在临床诊疗筛查中应用效果很好，PCR-膜杂交法在非高危性HPV的检测中应用效果较好，PCR检测HPV-DNA具有很高的特异性和敏感性。