全州县松毛虫卵期赤眼蜂种类多样性

罗 辑，钟雅婷，张 斌，赵锦文，邹东霞，常明山，蒋学建，吴耀军

（1.广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002；2.全州县林业局，广西桂林 541500）

松毛虫是鳞翅目（Lepidoptera）枯叶蛾科（Lasio⁃campidae）松毛虫属昆虫的统称，我国分布有27种，是为害松科（Pinaceae）、柏科（Cupressaceae）和杉科（Taxodiaceae）植物的主要食叶害虫[1]。桂林市为广西松树重要种植区，近些年松毛虫连年发生，对当地松树产业造成了较为严重的影响。广西桂林市主要有马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus）及思茅松毛虫（D.kikuchii），主要危害马尾松（Pinus massoni⁃ana）和湿地松（P.elliottii）。

目前，松毛虫的防治主要依靠菊酯类化学农药，以及阿维菌素和白僵菌等生物农药。化学农药见效快，防治效果好，能在较短时间内对松毛虫进行控制，是林农防治松毛虫的首选，但对环境会造成一定影响，也会导致松毛虫抗药性增加[2]。目前，政府部门推广使用的生物农药相对化学农药起效慢，但其药效期较长，对环境也相对友好，值得广泛推广[3]。这2种农药主要是防治松毛虫幼虫，如果监测不及时，当松毛虫已进入暴食期，会对松林造成较严重的损害。

赤眼蜂是昆虫卵期的寄生蜂，主要寄生在鳞翅目昆虫卵中。其在世界各地均有分布，是目前应用最广且最为成熟的生物防治手段之一[4-6]。为了利用本地赤眼蜂资源对当地松毛虫进行防控，本研究通过采集自然寄生的松毛虫卵块，调查全州县松毛虫卵期赤眼蜂的种类及丰度，为赤眼蜂的扩繁及全州县松毛虫的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地点

本研究在广西壮族自治区桂林市全州县展开，在前期调查松毛虫发生情况的基础上，选择全州县蔡家村（111°04′E，25°56′N）、周家坪村（111°02′E，25°58′N）、竹溪田村（110°59′E，25°57′N）、珠塘村（111°03′E，25°52′N）和三塘村（110°52′E，25°45′N）5个村的松林作为研究地点。

1.2 采样方法

2018年5月在上述研究地点，以“S”形踏查的方法在林间采集松毛虫卵块，每个样地采集20个卵块，将收集到的卵块分别装入单独的试管中，带回实验室，将试管放入光照培养箱中，在26℃、70%RH和L∶D=16∶8的条件下保存。每天观察试管中虫卵的状态，若松毛虫幼虫孵出，则去除；若有寄生蜂羽化，则收集保存于-20℃冰箱。

1.3 赤眼蜂的培养与分子鉴定

将单头赤眼蜂放入PCR管中，加入5 μL抽提液（100 mmol/L Tris-HCl，0.2 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，pH 9.5），用封口枪头捣碎后，放入PCR仪95℃加热10 min，4℃保存待用。分子鉴定所用COII引物参照Simon等[7]1994年的设计：5’-ATTG⁃GACATCAATGATATTGA-3’和 5’-CCACCAATTTC TGAACATTGACCA-3’，扩增片段大小为300 bp左右；所用ITS-2引物参照李正西等[8]2002年的设计：5’-TTCTCGCATCGATGAAGAACG-3’和5’-TCCTCC⁃GCTTATTGATATGC-3’，扩增片段大小为568 bp左右。在50 μL反应体积中进行PCR反应，反应体系为 DNA 模板 2 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L正向和反向引物各1.6 μL，Taq酶（天根）0.8 μL，双蒸水35 μL。在PCR仪（Ap⁃plied Biosystems SimpliAmp™）上进行PCR扩增反应，反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增35个循环；72℃延伸10 min后4℃保存。扩增反应结束后，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，将电泳条带正确的产物回收后送Invitrogen公司双向测通。

1.4 序列分析

在GenBank中分别搜索赤眼蜂属的COII及ITS-2序列，以分索赤眼蜂属（Trichogrammatoidea Girault）作为外类群。将序列用Mega X比对后，用Neighbor-Joining的方法同时使用Bootstrap 1 000次构建系统进化树。

1.5 多样性指数

根据研究尺度，生物多样性测定可分为α多样性、β多样性和γ多样性。α多样性主要关注局域均匀生境下的物种数目，本研究主要关注α多样性。α多样性指数按照香农-威纳指数（Shannon-Wiener index）公式计算。

2 结果与分析

2.1 赤眼蜂寄生率

本次共采集100个松毛虫卵块，其中68个为马尾松毛虫卵块，32个为思茅松毛虫卵块（表1）。蔡家村、周家坪村和珠塘村主要发现马尾松毛虫，竹溪田村主要发现思茅松毛虫，三塘村2种松毛虫数量相当。马尾松毛虫卵块和思茅松毛虫卵块赤眼蜂寄生率分别约为50%和65%。

2.2 赤眼蜂COII及ITS-2序列

每个被赤眼蜂寄生的松毛虫卵块中随机取10头赤眼蜂用于分子鉴定，共收集550头赤眼蜂。每头赤眼蜂均扩增测序COII及ITS-2序列用于种类鉴定。

去除PCR扩增失败和测序失败等因素导致未获得序列的数据，共获得赤眼蜂COII序列468条（图1a），ITS-2序列482条（图1b）。利用Mega X软件进行比对后，仅保留3’端第1个所有序列均有碱基的位点至5’端最后1个所有序列均有碱基的位点。最终获取COII合并序列231 bp，ITS-2合并序列361 bp。

将序列进行进化分析后发现，无论是COII基因还是ITS-2基因，赤眼蜂均分为3组，且3组赤眼蜂的数量在2个基因分类标准上相近（图1）。Group I数量最多，Group III数量最少。获得的赤眼蜂应该包括3个种类。

表1 全州县采集的松毛虫卵块数及被赤眼蜂寄生情况Tab.1 Egg masses of Dendrolimus collected in Quanzhou and parasitization by Trichogramma

图1 利用COII及ITS-2基因构建的无根进化树Fig.1 Rootless evolutionary trees constructed using COII and ITS-2 genes

2.3 赤眼蜂的种类

每组随机选取一些序列与NCBI中收集的序列进行比对，并构建进化树后，发现Group I与松毛虫赤眼蜂（T.dendrolimi）聚在一起，Group II与螟黄赤眼蜂（T.chilonis，也称拟澳洲赤眼蜂T.confusum）聚在同一分支上（图2）。Group III在利用COII基因进行分类时，自成一支后与T.brassicae及T.mwanzai聚在一支上，但Bootstrap值较低，仅有30左右；而在利用ITS-2基因进行分类时，Group III与T.umerus聚在一支，且Bootstrap值较高，此分支与玉米螟赤眼蜂（T.ostriniae）、粘虫赤眼蜂（T.leucaniae）及舟蛾赤眼蜂（T.closterae）聚在一支上。ITS-2构建的进化树中，T.brassicae及T.mwanzai与Group III不在同一分支上且距离较远，因此判断COII基因所构建的进化树不能很好地反映检测赤眼蜂的分类地位。

结合2个基因构建的进化树，Group I为松毛虫赤眼蜂，Group II为螟黄赤眼蜂，Group III为T.umerus。

图2 COII及ITS-2基因构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic trees constructed by COII and ITS-2 genes

2.4 全州县松毛虫卵期赤眼蜂多样性

5个地点赤眼蜂种类有所差异，在周家坪村仅发现松毛虫赤眼蜂，蔡家村发现松毛虫赤眼蜂及螟黄赤眼蜂，其他3个地点3种赤眼蜂均有发现（表2）。从数量上看，松毛虫赤眼蜂在各地分布较为均匀，各地数量间差异不显著；螟黄赤眼蜂在竹溪田村与三塘村差异不显著，但显著多于其他3个村（P＜0.05），三塘村显著多于周家坪村（P ＜0.05）；T.umerus在珠塘村显著多于其他4个村（P＜0.05）。珠塘村多样性指数最高（1.05），三塘村多样性指数与其接近（1.03），蔡家村多样性指数较低（0.27），周家坪村只发现1种赤眼蜂，指数为0。

表2 全州不同地点松毛虫卵赤眼蜂多样性Tab.2 Diversity of Trichogramma in different locations in Quanzhou

3 讨论

赤眼蜂是松毛虫卵期重要的寄生天敌，自然状况下赤眼蜂寄生率一般低于30%[9]，如果人工大量扩繁后进行林间释放，则会增加赤眼蜂寄生率，可对松毛虫进行适当防控[10-11]。桂林市全州县的赤眼蜂主要为松毛虫赤眼蜂，与文献报道的其他地区一致[12-14]。调查中还发现其他2种赤眼蜂种类，螟黄赤眼蜂也是松毛虫卵期的一种寄生蜂，但分布没有松毛虫赤眼蜂广泛，部分地区调查中未发现[15]；另一种赤眼蜂T.umerus是Jose等[16]在2005年发现的新种，此赤眼蜂被收集于日本琉球群岛，野外寄生于小菜蛾（Plutella xylostella）卵，也可寄生用于诱集赤眼蜂的地中海粉螟（Ephestia kuehniella）卵，除此之外未有其他报道，此赤眼蜂为国内首次报道，但具体定种还需后续形态学进一步核对。

在利用分子技术进行种类鉴定时，COII基因应用不如ITS-2基因广泛，导致提交到NCBI数据库中的赤眼蜂COII基因序列过少，影响了种类鉴定的准确性，而ITS-2序列相对较多，因此利用ITS-2基因的分类结果较为准确。本研究中COII基因的结果大部分可与ITS-2基因的结果相匹配，也验证了分类的准确性。

调查的5个地点中，有的地方只发现松毛虫赤眼蜂，有的地方发现3种赤眼蜂，可能是因为采样地的松毛虫发生情况不同。松毛虫发生较少的地方，采集的20个卵块分布面积较大；松毛虫发生较多的地方，采集的20个卵块分布较为集中，可能导致分布较少的赤眼蜂未能采集到。松毛虫种类的差异也有可能导致这样的结果，马尾松毛虫卵块较小，常多层覆盖，思茅松毛虫卵块较大，常单层排列于松针上，赤眼蜂仅能寄生裸露在表面的松毛虫卵块，导致思茅松毛虫卵块寄生率明显高于马尾松毛虫卵块，进而使得思茅松毛虫较多的点赤眼蜂种类可能更多。赤眼蜂寄生数量很大，而抽样数量有限，不一定所有种类赤眼蜂都能抽到。