高效液相色谱法测定大鼠体内复方扶芳藤合剂含药血清中人参皂苷Rb1的含量

周 围，谢金玲，钟卫干，周倍伊

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

复方扶芳藤合剂由扶芳藤、人参、黄芪等中药组成，临床用于治疗心脾两虚、气血不足等证。方中人参大补元气，益气生精止渴，补脾益肺，安神益智［1］。人参的主要活性成分人参皂苷Rb1能增加细胞内抗氧化酶活性，减少细胞脂质过氧化反应，明显抑制脑和肝中过氧化脂质形成，减少大脑皮层和肝中脂褐素的含量，同时也能增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在血液中的含量，具有抗氧化作用［2-4］。

近年来国内对复方扶芳藤合剂有效成分的检测进行了一些研究［5-6］，但对复方扶芳藤合剂含药血清中有效成分的检测尚未见报道。本文采用高效液相色谱法测定复方扶芳藤合剂含药血清中人参皂苷Rb1 的含量，为开展复方扶芳藤合剂含药血清中有效成分的测定提供一定的参考。

1 实验材料

1.1 动物 SD雄性大鼠120只，体质量180～200 g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物许可证号:SYXK桂2010-0001。

1.2 试药 复方扶芳藤合剂样品由广西中医药大学制药厂提供（批号20181010，批准文号:国药准字Z45021781）；人参皂苷Rb1 对照品（纯度91.2%，购自中国药品生物制品检定所，批号:110704-201827）；乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。

1.3 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪，含Wa⁃ters 2998 PDA 光电二极管矩阵检测器（美国沃特世公司）；赛多利斯SECURA225D-1CN 天平（德国Sartorius 公司）；Allegra X-22R 台式高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）；ELGA Classic UV 超纯水系统（英国埃尔格公司）；海尔DW-86L386 超低温冰箱（中国海尔）；Organomation MICROVAP 118 氮吹仪（美国Organomation公司）。

2 方法与结果

2.1 大鼠含药血清样品的制备 采用随机数表法，将SD 大鼠分为4 组，每组30 只:复方扶芳藤合剂低剂量组（A）、复方扶芳藤合剂中剂量组（B）、复方扶芳藤合剂高剂量组（C）和空白对照组（D）。复方扶芳藤合剂低、中、高剂量组连续7 d灌胃给药，给药剂量分别为2.72 ml/kg、5.43 ml/kg、10.87 ml/kg，每天1次；空白对照组灌胃给予等容量的生理盐水。末次给药后腹腔主动脉取血（取血前禁食过夜，正常给水，按3 ml/kg 10%水合氯醛麻醉），3 000 r/min 离心10 min，56 ℃水浴锅灭活30 min，即得对应血清，-80 ℃冰箱保存。

2.2 人参皂苷Rb1含量的测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rb1 对照品约5 mg，精密称定为5.202 mg，转移至5 ml 棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得每1 ml含1.04 mg人参皂苷Rb1的对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取各剂量组的含药血清1 000 μl，解冻，加3 000 μl 乙腈旋涡混合2 min，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，氮气吹干，用1 000 μl甲醇溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤［7］，作为待测定的供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液的制备 取空白对照组大鼠血清1 000 μl，解冻，加3 000 μl 乙腈旋涡混合2 min，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，氮气吹干，用1 000 μl甲醇溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，作为待测定的阴性溶液。

2.2.4 色谱条件 色谱柱:welch Μltimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温:25 ℃；流动相:乙腈∶水（33∶67）等度洗脱；流速1.0 ml/min；检测器为2998 PDA Detector 检测器。结果表明，在此洗脱条件下，血清中其他物质不干扰人参皂苷Rb1 的测定，复方扶芳藤合剂中其他成分对实验结果也没有影响，峰形良好，出峰时间为12.992 min（见图1、图2、图3）。

图1 人参皂苷Rb1对照品溶液

图2 阴性溶液

图3 供试品溶液

2.2.5 线性关系考察 使用自动进样器精密吸取人参皂苷Rb1对照品储备液1 μl、2 μl、4 μl、6 μl、8 μl、10 μl、12 μl、14 μl、16 μl，按2.2.4项下色谱条件进样分析，测定并记录人参皂苷Rb1 的峰面积。以峰面积积分值Y 对进样量X（μg）进行线性回归，求得人参皂苷Rb1 回归方程为Y=197 011 X-220 764（r2=0.999 5）。实验结果显示，人参皂苷Rb1 在1.02～16.32 μg 范围内，其峰面积Y 与进样量X（μg）呈良好的线性关系（n=9）。

2.2.6 稳定性试验 在2.2.4 项色谱条件下，精密吸取同一大鼠复方扶芳藤合剂含药血清的供试品溶液10 μl，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 进样分析，测定并记录人参皂苷Rb1 的峰面积，计算得RSD 为2.0%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 精密度试验 在2.2.4 项色谱条件下，精密吸取人参皂苷Rb1 对照品溶液10 μl进样分析，重复进样6 次，测定并记录人参皂苷Rb1 的峰面积，计算RSD为2.7%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一大鼠复方扶芳藤合剂含药血清，按2.2.2 项下制备供试品溶液6 份。取各供试品溶液，在2.2.4 项色谱条件下进样10 μl，测定并记录人参皂苷Rb1 的峰面积，计算人参皂苷Rb1 平均含量，结果平均含量为80.78 μg/ml，RSD 为1.62%（n=6），结果表明该测定方法重复性良好。

2.2.9 加样回收试验 取同一大鼠复方扶芳藤合剂含药血清，精密量取6 份，每份0.5 ml，精密加入含人参皂苷Rb1 1.04 mg/ml 的对照品储备液0.4 ml，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，在2.2.4 项色谱条件下进样分析，测定并记录人参皂苷Rb1的峰面积，计算加样回收率。结果平均回收率为102.4%，RSD=1.26%（n=6）。见表1。

表1 加样回收率试验结果 （n=6）

2.3 含量测定 依据分组处理得到对应血清，按2.2.2 项下方法制备各供试品溶液。在2.2.4 项色谱条件下进样分析，测定并记录人参皂苷Rb1 的峰面积。各个样品重复测定3 次，计算每组样品中人参皂苷Rb1的含量，结果见表2。

表2 含药血清中人参皂苷Rb1的含量测定结果 （n=3）

3 讨 论

含药血清作为实验检测样本成分复杂，血清内蛋白质含量高，直接进样分析，不仅会损坏仪器，还会产生过多的杂质峰，对人参皂苷Rb1 出峰分离造成干扰，同时还会消耗大量的流动相溶剂，延长进样分析时间。本研究在含药血清中加入乙腈，使血清内的蛋白变性，离心后的上清液用氮吹法浓缩纯化，经处理后的检测样本符合检测要求。

实验中以不同梯度的乙腈∶水作为流动相进行梯度考察，并控制出峰时间，保证目标成分的峰形无拖尾。当乙腈∶水=33∶67 时，人参皂苷出峰时间为12.992 min，其峰面积Y 与进样量X（μg）呈良好线性关系，r2=0.999 5；平均加样回收率为102.4%，RSD 为1.26%（n=6）。由于检测样本处理得当，其他组分相互之间干扰较小，每组耗时缩短，减少使用流动相溶剂，节约进样分析时间。实验结果证明，该方法对大鼠体内复方扶芳藤合剂含药血清中人参皂苷Rb1的含量测定结果稳定，重复性良好。