转录因子Dlx1在HT22细胞中调控CRMP2转录活性的研究

束慧

摘 要 目的：观察转录因子Dlx1对小鼠海马神经元细胞HT22细胞CRMP2（ Collapsin response mediator protein 2）基因的调控作用。方法： 构建pcDNA3.1-HA-Dlx1质粒及pGL3.0-Basic-CRMP2 promoter质粒，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测Dlx1对CRMP2基因启动子转录的影响; 检测过表达Dlx1对内源CRMP2基因表达的影响。结果：Dlx1直接结合在CRMP2启动子上，促进CRMP2基因表达。结论： Dlx1促进CRMP2基因表达。

关键词 Dlx1 脑衰反应调节蛋白-2 启动子 双荧光素酶基因检测

中图分类号：R780.2文献标识码：A

脑衰反应调节蛋白2 （Collapsin response mediator protein 2， CRMP2）是CRMPs家族成员之一，均由564-572个氨基酸残基组成。人源CRMP2基因定位于8p21.2，转录本Ⅱ与小鼠CRMP2基因编码的蛋白氨基酸残基长度均为572aa，只有两个氨基酸不同。CRMP2表达量的下降和活性的降低均会引起神经系统疾病，如帕金森疾病、精神分裂症和阿尔茨海默症等。

Dlx1属于Dlx基因家族成员之一，有研究表明Dlx家族基因在神经元发育中有很重要的作用。本实验通过观察Dlx1对CRMP2基因启动子转录活性的影响，以及转录活性之间的关系，为进一步研究CRMP2基因表达的调控奠定了一定基础。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

HT22细胞株（实验室保留）;CRMP2质粒构建引物（苏州金唯智生物科技有限公司）;二抗山羊抗兔（美国Abcam，ab6721）;CRMP2 siRNA（吉玛基因股份有限公司）; CRMP2抗体（美国Abcam，ab129082）;Lipofectamine 2000转染试剂（美国Invitrogen， 11668019）;蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，p0012）;胎牛血清（美国Hyclone，Sh30370.03）;RPMI-1640培养基（美国Hyclone，Sh30809.01）;Ripa裂解液（康为世纪，  CW2334）;DNA质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）;双荧光素酶报告基因检测系统（美国 Promega 公司）。

1.2质粒构建

采用PCR方法扩增得到鼠源Dlx1 cDNA片段，使用EcoR1/BamH1限制性内切酶处理后插入pcDNA3.1-HA载体，构建成pcDNA3.1-HA-Dlx1质粒，PCR引物序列：上游引物序列- CCG GAATTC ATGACCATGACCACCATGCCAG，下游引物序列- GCG GGATCC TCACATCAGTTGAGGCTGCTGC。采用PCR方法擴增得到鼠源CRMP2启动子片段，使用Kpn1/Mlu1限制性内切酶处理后插入pGL3.0-Basic载体，构建成pGL3.0-Basic-CRMP2 promoter质粒，PCR引物序列：游引物序列-CGG GGTACCAAATATAAATATATATATATTTTAA，下游引物序列-GCACGCGT TCTCTCCGGGGGGCGGGAGGAAG。

1.3  Dlx1对CRMP2启动子（-102- +1）103bp转录活性的影响

1.3.1不同浓度Dlx1对CRMP2启动子转录活性的影响

HT22细胞株培养于RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清，1%霉素/链霉素双抗），置 5% CO2，37℃细胞培养箱培养。取生长状态稳定HT22细胞铺板，培养过夜，待细胞丰度达到大约70%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。将pcDNA3.1-HA载体，pcDNA3.1-HA-Dlx1质粒分别按不同的浓度（50ng，100ng，200ng）和pGL3-Basic -CRMP2 promoter质粒（300ng），Renilla质粒（10ng）共转染到12孔板 HT22细胞，各转染3个孔。48 h后收集细胞，分别使用100L 细胞裂解液裂解细胞，充分裂解，离心后取20L上清液用于双荧光素酶报告基因试剂盒检测，具体步骤参考说明书。

1.3.2小鼠CRMP2基因启动子特征性序列的定点突变

将小鼠CRMP2启动子序列进行转录因子结合位点分析（http：//jaspar. genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl），结果显示转录因子Dlx1在预测得到的CRMP2启动子区域具有潜在结合位点（tataaatata）。设计突变引物，将tataaatata序列突变掉构建突变质粒，将得到的突变质粒送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，将所得结果使用NCBI。

1.3.3检测Dlx1对CRMP2野生型和突变型基因启动子转录活性的影响

将pcDNA3.1-HA载体，pcDNA3.1-HA-Dlx1质粒分别和pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter质粒及突变质粒，Renilla质粒共转染到12孔板HT22细胞，各转染3个孔。按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。将pcDNA3.1-HA-Dlx1质粒按不同的浓度（50ng，100ng，200ng）分别和pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter质粒/突变质粒（300ng），Renilla质粒（10ng）共转染到12孔板 HT22细胞，各转染3个复孔。48 h后收集细胞，分别使用100L 细胞裂解液裂解细胞，充分裂解，离心后取20L上清液用于双荧光素酶报告基因试剂盒检测，具体步骤参考说明书。

1.4  Dlx1促进内源性CRMP2基因表达

将pcDNA3.1-HA载体和pcDNA3.1-HA-Dlx1质粒分别转染到12孔板HT22细胞中，每孔转染500ng，各转染6个复孔;在HT22细胞中分别转染10ul NC siRNA和siRNA CRMP2（浓度均为1nM）。48h后，提取mRNA和蛋白质，分别做Q-PCR和Western Blot检测CRMP2的mRNA和蛋白变化。Q-PCR引物序列：上游引物序列-GGGATCTGATGCTGACTTGGTC，下游引物序列-GGGAATGTAGCGTCCTGAGC。将收集的蛋白质采用BCA试剂盒定量后，浓度调至一致，加入5咨涎撼逡海？5 ℃煮沸15 min。将30ug蛋白样品加到10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上样孔中，80V电泳20min，120V电泳120min，使用PVDF膜转膜 （恒定电流：330 mA，70min）。室温下5%的小牛血清封闭1 h，孵育CRMP2及GAPDH抗体（1：5000）室温2h，TBST洗膜4次，每次5 min，孵育山羊抗兔二抗（1：10000）室温下孵育1 h，洗膜4次，每次5 min，ECL发光液曝光收集结果。

1.5统计学处理

实验数据采用单因素方差分析和双因素方差分析来进行显著性分析，p<0.05 表示差异具有统计学意义，用Graph Pad Prism进行统计学分析，数据均以均值北曜嘉蟊硎尽？

2结果

2.1不同浓度Dlx1对CRMP2启动子转录活性的影响

检测不同浓度的转录因子Dlx1质粒与pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter質粒共转染HT22细胞时发现，随着Dlx1浓度的增高，pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter质粒的荧光素酶活性显著增高，差异有统计学意义（ P <0.001） ，结果如图1所示。

图1：pcDNA3.1-HA载体，不同浓度的转录因子Dlx1质粒分别与pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter质粒共转染HT22细胞，以Renilla为内参，使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光酶的活性，结果显示，随着转录因子Dlx1浓度的增高，荧光素酶的活性也随之增强，p<0.001。

2.2  Dlx1对CRMP2野生型和突变型启动子质粒荧光素活性的影响

通过生物信息学的分析，我们将Dlx1在预测得到的CRMP2启动子区域具有潜在结合位点，通过PCR定点突变的方法去掉，构建突变质粒。然后将Dlx1分别与CRMP2野生型和突变型启动子质粒转染，检测荧光素酶的活性。Dlx1对野生型CRMP2启动子质粒荧光素活性有激活作用，差异有统计学意义（p<0.001）;对CRMP2突变型启动子质粒荧光素活性无明显激活作用，差异无统计学意义（p>0.05），结果如图2所示。

图2：pGL3.0-Basic-CRMP2 promoter质（下转第293页）（上接第288页）粒中的Dlx1结合位点突变后，Dlx1不能促进光素酶的活性增强，差异无统计学意义（p>0.05），说明Dlx1可以直接结合在CRMP2启动子，并促进其转录。

2.3  Dlx1促进内源性CRMP2基因表达

将不同浓度pcDNA3.1-HA-Dlx1质粒瞬时转染到HT22细胞，采用Q-PCR和Western Blot方法检测CRMP2 mRNA和蛋白水平的变化，CRMP2 mRNA和蛋白水平均升高，有统计学意义（p<0.05，p<0.001），结果如图3-A和3-B所示;在HT22细胞中Knock-down Dlx1，CRMP2 mRNA和蛋白水平均下降，有统计学意义（p<0.05）结果如图3-C和3D所示，说明Dlx1可以促进CRMP2基因表达。

图3-A：不同浓度过表达Dlx1组与对照组相比，CRMP2 mRNA水平显著升高，差异有统计学意义（p<0.05，p<0.001）;图3-B：不同浓度过表达Dlx1组与对照组相比，CRMP2 蛋白水平显著升高，差异有统计学意义（p<0.05）;图3-C：Knock-down Dlx1组与对照组相比，CRMP2 mRNA水平下降，差异有统计学意义（p<0.05）;图3-D：Knock-down Dlx1组与对照组相比，CRMP2 蛋白水平下降，差异有统计学意义（p<0.05）。

3讨论

近年来，蛋白质组学已得到广泛应用，为一些疾病发病机制的研究带来了更宽广的思路。诸多实验已证明，CRMP2在神经系统疾病中起到重要作用，其表达贯穿神经元生命始终，发育阶段达到高峰。同时CRMP2的表达量和神经元位置也有相关性，例如，在小脑、海马和嗅球等处CRMP2 表达较多。

本实验通过采用生物信息学的方法，预测出转录因子Dlx1可能调控CRMP2的基因表达，并通过相关实验加以验证，首次发现，转录因子可以直接结合在CRMP2启动子上，并促进CRMP2基因表达。基因转录过程十分复杂，通常情况下，许多转录因子形成复合物共同起调控作用，所以我们不能排除还有其他转录因子也参与这一调控过程，具体还有哪些转录因子参与调控有待我们进一步研究探索。

综上所述，转录因子Dlx1与CRMP2启动子相互结合从而调控其表达水平，为一些疾病发病研究和治疗提供一定的理论支持。