基于网络药理学的金芪降糖片保护血管作用机制研究

蒙 涛，骆 玺，王 强

(中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074)

糖尿病所致的血管内皮功能障碍引起的糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死、致残的重要原因，寻找有效保护血管内皮细胞的药物对防治糖尿病具有重要意义[1]。中医经典方剂金芪降糖片由黄连、黄芪和金银花3味中药配伍而成，具有降血糖、保护血管和改善糖尿病血管并发症的作用[2]。虽然金芪降糖片在糖尿病血管并发症的治疗方面颇有成效，但其成分复杂、活性多样的特点，使其作用机制尚未阐明。

网络药理学融合了系统生物学、计算生物学等多学科的技术和内容，从整体和系统的角度去探索药物与疾病间的关联性，阐明药物作用机制[3]，其系统性、整体性的特点与中医中药整体观、辨证论治的原则不谋而合，目前己被广泛应用到中医药研究领域[4-5]。本研究运用网络药理学方法，旨在探讨金芪降糖片保护血管的作用机制。

1 材料与方法

1.1 黄芪降糖片有效成分的获取

从TCMSP数据库中获得黄连、黄芪、金银花已知的化学成分，以口服生物利用度(OB≥30%)、类药性(DL≥0.18)和Caco-2渗透性(Caco-2≥0.40)为参数，筛选出活性较高的化合物[6]，获取化合物PubChem CID，并从化合物的“Related targets”中获得其对应的预测靶点，然后利用Uniprot数据库对所得到的化合物预测靶点名称进行矫正统一。

1.2 关键靶点筛选

将矫正后的化合物靶点基因名称上传到CTD(http：//ctdbase.org/)数据库，利用其自身的Set Analyzer分析工具，设置P-value≤0.01，对靶基因进行疾病聚类(Enriched Diseases)，在结果中选择Vascular Diseases，筛选出保护血管关键靶点。

1.3 疾病靶点GO注释及通路分析

利用Cytoscape软件的GlueGO工具，对筛选出的血管保护关键靶基因进行GO (gene ontology) 生物学过程富集分析和KEGG (KEGG pathway analysis)通路注释分析，设定阈值P<0.05，选取具有显著性差异的所有通路。

1.4 成分-靶点-通路网络的构建

利用软件 Cytoscape 3.6.1，根据上述收集到的化合物及其预测靶点、通路，构建“成分-靶点-通路”网络图。在网络图中，化合物、靶点、通路等信息用节点(Node)表示，化合物与其潜在作用靶点、靶点参与的疾病均以边(edge)相连。以节点大小表示节点度(degree)，节点的度(degree)值越大，则这个点对应的成分、靶点或通路越有可能是作用机制中的关键点。

1.5 有效指数计算

以有效指数(Er)评价化合物对通路的作用效果，筛选出金芪降糖片保护血管的关键通路。

注：NT为该化合物作用的靶点总数，NTP为该化合物作用的靶点中参与该条通路的靶点数目，NP为该条通路的靶点总数。

1.6 整合通路构建

根据分子对接结果，将活性成分作用靶点的基因名称导入KEGG数据库，利用KEGG mapping工具，将靶点映射到对应通路获取通路图，得出金芪降糖片保护血管的关键作用机制。

1.7 活性成分与靶蛋白分子对接

利用Sybyl 1.0软件对关键通路对应的成分靶点进行分子对接计算，以验证关键靶蛋白与对应化合物的结合活性。在PDB (http：//www.rcsb.org/pdb/)蛋白数据库中下载含有原配体的靶蛋白晶体结构及其配体结构。利用PubChem CID，在PubChem数据库检索并下载对应金芪降糖片活性化合物的3D结构(sdf格式)，之后利用ChemDraw 3D将sdf格式的化合物文件转换为mol2格式文件。运用Sybyl软件中的SurFlex-Dock模块，选定靶蛋白中的原配体小分子药物结合位点为活性中心，采用总分(Total Score)函数作为打分函数，进行对接计算。

2 结果

2.1 化学成分

从TCMSP 数据库中分别获得黄连、黄芪、金银花目前已知成分48、87、236 种，具有较好口服生物利用度(OB≥30%)、类药性(DL≥0.18)和Caco-2渗透性(Caco-2≥0.40)的化合物分别为黄连9种、黄芪12种、金银花10种，其中24个化合物预测与115个靶点相关，见表1。

表1 金芪降糖片成分筛选结果

续表1

No.PubChemCIDMolecule NameOB (%)Caco-2DL相关靶点数来源M226436722phytofluene43.182.290.500金银花M235280489beta-carotene37.182.250.5822金银花M245281235kryptoxanthin47.251.690.570金银花M256371716Ethyl linolenate46.101.540.202金银花M265282184Mandenol42.001.460.193金银花M275280794Stigmasterol43.831.440.7631金银花M2811870462ZINC0397878143.831.320.760金银花M29222284beta-sitosterol36.911.320.7538金银花M305380108All-trans-Rhodoxanthin31.221.170.550金银花M3110970376Corymbosin51.960.880.4126金银花

2.2 CTD筛选及ClueGO分析结果

由CTD筛选出血管保护核心靶点49个，见表2。由ClueGO分析，49个核心靶点最相关的通路和生物过程(前15个)，见图1。结果显示，这些基因主要参与循环系统中的血管过程(Vascular process in circulatory system)、调节钙离子转运(Regulation of calcium ion transport)、调节血管直径(Regulation of blood vessel diameter)等生物过程。在KEGG通路中，这些基因涉及糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌症相关的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)等信号通路。

2.3 成分-靶点-通路网络的构建

图2为金芪降糖片成分-靶点-通路网络，其中包含了66个节点和229条边。66个节点中包括21个化合物，30个潜在靶点和15条通路。由网络图可知，化合物 M23、M29和M13具有较大节点度(degree)值，是金芪降糖片主要活性成分，PTGS2、NOS3和NOS2相邻化合物节点最多，分别有多个活性化合物与之结合。

图1 GlueGO分析结果

表2 CTD筛选结果

图2 金芪降糖片成分-靶点-通路网络

2.4 有效指数计算分析和通路图获取

活性化合物对相关通路的有效指数Er计算结果见图3，计算值越大说明化合物对该通路作用越强。有效指数计算结果显示，金芪降糖片活性化合物对VEGF信号通路作用最强，其中化合物M23对多条通路均有显著作用。在KEGG数据库，利用KEGG mapping工具，将参与VEGF信号通路的金芪降糖片活性化合物相关靶点映射到VEGF信号通路获取通路图，得到金芪降糖片保护血管核心作用机制，见图4。

2.5 分子对接计算分析

以分子对接计算，验证金芪降糖片活性化合物与VEGF信号通路相关靶蛋白的结合活性。根据有效指数Er计算结果，筛选出对VEGF信号通路活性最高的10个化合物，与对应的关键靶蛋白CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2进行分子对接，对接计算结果见表3。结果显示，4个靶蛋白均有2个或2个以上的化合物对接打分接近或者超过原配体小分子，显示金芪降糖片活性化合物对上述靶蛋白具有较好的结合活性。

图3 有效指数计算结果

注：红色为金芪降糖片活性化合物潜在作用靶点图4 VEGF信号通路

表3 分子对接结果

3 讨论

金芪降糖片对糖尿病所致的血管并发症具有较为显著的治疗作用，针对中药及其复方研究局限性的限制，本研究运用网络药理学方法分析金芪降糖片保护血管的分子机制。本研究收集到金芪降糖片24个活性化合物可能作用于115个靶蛋白，其中49个核心靶点(表2)涉及血管病变，这提示金芪降糖片活性化合物可能是通过作用于这49个核心靶点保护血管。通过ClueGO分析生物过程富集(图1)发现，金芪降糖片保护血管的活性成分潜在作用靶点在循环系统中的血管过程、调节钙离子转运和调节血管直径等生物过程富集，这些生物学过程紊乱很可能是病理性血管损伤的原因，同时表明金芪降糖片可能通过改善这些生物过程发挥其保护血管的作用。KEGG通路富集(图1)以及“成分-靶点-通路”网络(图2)分析发现，金芪降糖片保护血管的活性成分潜在作用靶点参与糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、癌症相关的蛋白聚糖、流体剪切应力和动脉粥样硬化等信号通路，这些通路异常也是糖尿病血管病变的诱因，同时也有大量文献证实金芪降糖片通过调控这些通路发挥其保护血管的作用。

高级糖基化终产物(AGEs)是诱导血管内皮细胞功能紊乱，引发糖尿病血管并发症的重要原因。尹登科等[7]研究证实，黄连多糖能显著减少高级糖基化终产物(AGEs)诱导下人脐静脉内皮细胞高级糖基化终产物受体(RAGE)的表达，降低AGEs对内皮细胞的激活作用，进而改善AGEs诱导的内皮细胞损伤。血液流体剪切应力异常也是诱导内皮功能紊乱的重要因素。当归补血汤由当归和黄芪配伍而成，秦臻等[8]研究证实，增大当归补血汤中黄芪的比例，可促进低血液流体剪切应力作用下受损内皮细胞的eNOS表达和NO分泌，进而显著增强血管内皮保护效应。这些研究结果充分显示出金芪降糖片调节AGE-RAGE信号通路，改善血液流体剪切应力异常，保护血管内皮细胞的作用，与本文网络药理学研究结果一致。

根据活性化合物对相关通路的有效指数Er计算结果(图3)分析发现，金芪降糖片活性化合物对VEGF信号通路作用最强，其中涉及血管内皮生长因子(VEGF)、半胱氨酸蛋白酶9(CASP9)、丝裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、一氧化氮合酶(NOS3)、环氧合酶2(PTGS2)等5个靶点。根据VEGF信号通路图(图4)的信息以及查阅的相关文献，发现参与VEGF信号通路的5个金芪降糖片活性化合物作用的靶点在糖尿病血管病变中发挥着重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)能有效诱导血管再生，王兴木等[9]研究发现，糖尿病视网膜病变患者血清中的血管内皮生长因子水平随着病变的加重而显著增加，这表明血管内皮生长因子在糖尿病视网膜病变的发生、发展中起着重要作用。此外，VEGF也能通过影响下游靶点，调节内皮细胞功能。Xu等[10]研究发现，VEGF过表达可影响PI-3K/AKT/m-TOR/eNOS和p38/MAPK信号，进而改善棕榈酸诱导的糖尿病内皮细胞功能障碍。PI3K/AKT/mTOR磷酸化活化后，促进细胞周期，加速细胞增殖[11]。AKT磷酸化可促进eNOS磷酸化催化产生NO[12]，适量的NO 分泌可保护血管内皮功能，而过量的NO分泌则会引起内皮细胞通透性的改变，致使内皮细胞功能紊乱，引起血管内皮损伤[13]。P38/MAPK信号通路则通过调节胶原纤维蛋白原和纤溶酶原活性，诱导内皮细胞迁移和细胞骨架重组[14]。NO和PGI2是VEGF信号下游的分子，分别由eNOS和PTGS2催化产生，Fedorowicz等[15]研究证实，NO和PGI2依赖的机体功能受损是糖尿病主动脉内皮功能障碍的重要因素。这些研究结果提示金芪降糖片活性化合物可能通过作用于上述靶点，调节VEGF信号通路，进而保护血管，改善糖尿病血管并发症。

现代药理学研究指出，金芪降糖片活性化合物具有改善VEGF信号，进而保护血管的作用。郑凝等[16]发现金芪降糖片具有抑制RAGE表达，降低肾组织VEGF、TGF-β1、CTGF 水平的作用。封芬等[17]研究发现，黄连素治疗可促进糖尿病大鼠胸主动脉PI3K、Akt 和eNOS等蛋白表达，证实黄连素可能是通过激活PI3K/Akt/eNOS信号途径，改善糖尿病血管内皮功能。本研究分子对接结果显示(表3)，金芪降糖片活性化合物黄连素(M2)、表小檗碱(M5)、β-胡萝卜素(M23)和十八碳二烯(M26)分别与2个或2个以上的靶蛋白对接打分接近或者超过原配体小分子，显示出对VEGF信号通路靶蛋白具有较好的结合活性，这提示这4个化合物可能是金芪降糖片调节VEGF信号通路的主要活性化合物。其中，黄连素分子对接结果与文献报道相符，进一步证实本研究结果的准确性。

本研究从网络药理学角度探讨并揭示了金芪降糖片保护血管的主要成分、作用靶点和相关生物信号通路。网络分析推测金芪降糖片活性化合物主要通过作用于VEGF、CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2等5个靶点，影响VEGF信号通路，从而起到保护血管的作用，其中发挥作用的关键活性化合物可能是黄连素、表小檗碱、β-胡萝卜素和十八碳二烯。本研究为进一步深入探讨金芪降糖片保护血管的作用机制提供借鉴。