虎杖标准汤剂质量标准研究

李 燕，刘 聪，陈玉梅，胡昌江*，许润春

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都611137；2.四川新绿色药业科技发展有限公司/国家企业技术中心/国家中医药管理局“中药配方颗粒质量与疗效评价”重点研究室，四川 成都 611900)

虎杖来源于蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎和根[1]，为常用清热药，主产于华东、中南、西南等地，包括四川、贵州、浙江、安徽、陕西、广东等省市[2]。具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效，用于治疗湿热黄疸、淋浊、带下、风湿痹痛等症[1]。虎杖主要化学成分包括蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、香豆素类以及一些脂肪酸类化合物等，具有抗菌、抗病毒、扩血管、抗血栓等多种药理作用[3-7]。根据2016年国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，中药标准汤剂系遵循中医药理论，采用合格饮片按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得，作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物[8]。标准汤剂系由不少于15批原料分别制得，计算相关平均值，并规定其变化可接受的范围。中药配方颗粒的所有药学研究均须与标准汤剂进行对比，以保证与标准汤剂质量的一致性。

虎杖作为中药的重要品种，目前对其标准汤剂的研究报道较少。本研究严格遵循相关文件中标准汤剂制备的要求，收集主产区的20批虎杖药材制备标准汤剂，以虎杖苷和大黄素为指标成分，测定其含量，计算转移率和出膏率范围，并进行指纹图谱研究，为虎杖标准汤剂质量标准的制定提供研究数据，同时为虎杖配方颗粒质量标准研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；CT-C-3型热风循环烘箱(杭州金竺机械有限公司)；MS205DU型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；ME204E/02型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；细胞型1810A超纯水机(上海摩勒科学仪器有限公司)；KQ5200DB型超声波清洗器(600 W，40 kHz；昆山市超声仪器有限公司)；分体式陶瓷煎药壶4 L(美味世家)；LGJ-100F型真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

1.2 药品及试剂

按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)的要求共收集20批来自四川、贵州、浙江、安徽、陕西等主产区的虎杖药材(经成都中医药大学胡昌江教授鉴定为蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎和根)，并加工成饮片，饮片具体信息见表1。虎杖苷(中国食品药品检定研究院，批号：111575-201603，含量以87.3%计)，大黄素(中国食品药品检定研究院，批号：110756-201512，含量以98.7%计)，白藜芦醇(中国食品药品检定研究院，批号：11535-201703，含量以99.4%计)；乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 饮片产地信息

2 方法和结果

2.1 虎杖饮片含量测定

采用 《中国药典》 2015版方法，以Agilent ZORBAX Extend-C18为色谱柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)为流动相；检测波长为254 nm，测定饮片的大黄素含量；以乙腈-水(23∶77)为流动相；检测波长为306 nm，测定饮片的虎杖苷含量。结果见表3。

2.2 虎杖标准汤剂制备[9]

根据前期的预实验，确定虎杖标准汤剂制备方法为：取虎杖饮片150 g，加水煎煮二次，一煎加8倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮20 min，200目筛网过滤；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮15 min，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，进行真空冷冻干燥，得到虎杖标准汤剂干燥粉末，收膏率见表2。

续表2

饮片批号饮片投料量(g)标准汤剂批号标准汤剂收粉量(g)标准汤剂收膏率(%)HZ180409150.2HZBT18040925.517.0HZ180410150.6HZBT18041026.617.6HZ180411150.4HZBT18041124.816.5HZ180412150.4HZBT18041226.117.3HZ180413150.0HZBT18041326.317.5HZ180414150.3HZBT18041426.617.7HZ180415150.4HZBT18041525.016.6HZ180416150.2HZBT18041625.216.8HZ180417150.0HZBT18041724.316.2HZ180418150.2HZBT18041824.316.2HZ180419150.8HZBT18041924.216.1

由表2计算可知，20批虎杖标准汤剂出膏率的范围为14.9%～19.0%，平均值为17.1%，平均值的70%～130%的范围为12.0%～22.2%。

2.3 虎杖标准汤剂含量测定

2.3.1 色谱条件 采用Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱(柱长为250 mm，内径为4.6 mm，粒度为5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～45 min，15%～65%A)；流速为mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长分别为254 nm(大黄素)、306 nm(虎杖苷)；进样体积10 μL。色谱见图1。

图1 虎杖苷、大黄素对照品和样品HPLC色谱

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品约0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600 W，频率40 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 线性关系考察 分别取混合对照品溶液(虎杖苷302.8 μg·mL-1；大黄素23.4 μg·mL-1)1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL、8 μL注入液相色谱仪，分别得到峰面积，以进样量(X，μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标计算得到回归方程，虎杖苷Y=4744X-22.66，r=0.999，线性范围0.263 4～2.107 5 μg；大黄素Y=5326X-4.133，r=0.999，线性范围0.263 4～2.107 5 μg，0.023 1～0.184 5 μg；虎杖苷和大黄素在各自范围内均呈良好线性关系。

2.3.4 精密度实验 取配置的混合对照品溶液按“2.3.1”项下方法连续进样6次，记录虎杖苷和大黄素的峰面积，计算得到虎杖苷峰面积的RSD为1.3%(n=6)，大黄素峰面积的RSD为0.8%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性实验 取本品(批号HZBT180218)0.1 g，精密称定6份，按照拟定的方法制成供试品溶液，按“2.3.1”项下方法进样分析，计算6份供试品含量的RSD值，得到虎杖苷含量RSD为1.2%(n=6)，大黄素RSD为0.6%(n=6)，符合要求，表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h测定虎杖苷和大黄素色谱峰面积，计算得到虎杖苷峰面积的RSD为0.6%(n=6)，大黄素峰面积的RSD为0.9%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 加样回收实验 取已知含量的供试品(批号HZBT180218，虎杖苷5.52%，大黄素0.29%)0.05 g，共6份，精密称定，根据标准汤剂中两成分的含量按1∶1 的比例添加虎杖苷对照品和大黄素对照品，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，得虎杖苷平均回收率为101.86%，RSD为1.03%(n=6)；大黄素平均回收率为97.54%，RSD为0.52%(n=6)，表明该方法的准确度良好。

2.3.8 虎杖标准汤剂含量测定 按拟定的方法对20批虎杖标准汤剂进行虎杖苷和大黄素含量测定，并计算其转移率(转移率=标准汤剂中虎杖苷(大黄素)量/饮片中虎杖苷(大黄素)量×100%)，结果见表3。

表3 虎杖标准汤剂含量测定结果

结果表明，虎杖标准汤剂中虎杖苷含量范围为3.2%～8.2%，均值为6.4%，大黄素含量范围为0.2%～0.4%，均值为0.3%；虎杖苷转移率为19.2%～42.7%，平均值31.2%；大黄素转移率为1.8%～3.2%，平均值2.4%。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 色谱条件 采用Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱；(柱长为250 mm，内径为4.6 mm，粒度为5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～45 min，15%～65%A)；流速为1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长为280 nm；进样体积10 μL。样品图谱见图2。

2.4.2 对照品溶液制备 取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL各含50 μg的溶液，即得。对照品图谱见图2。

2.4.3 供试品溶液的制备 同“2.3.2”项下供试品溶液制备方法。

2.4.4 精密度试验 取同一批虎杖标准汤剂供试品溶液，按“2.4.1”项下方法连续进样6 次，以虎杖苷(2号峰)为参照峰，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD，结果表明各峰保留时间RSD<0.1%(n=6)，相对峰面积RSD<2.0%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.5 重复性试验 平行制备6 份虎杖标准汤剂供试品溶液，按“2.4.1”项下方法进样，测定供试品溶液中各共有峰的保留时间和峰面积。以虎杖苷(2号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明各峰相对保留时间的RSD<0.10%(n=6)，相对峰面积的RSD<1.8%(n=6)，表明该方法重复性较好。

2.4.6 稳定性试验 取虎杖标准汤剂供试品溶液，分别于供第0、2、4、8、12、20、24 h按“2.4.1”项下方法进样测定，以虎杖苷( 2号峰) 为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果各峰相对保留时间的RSD<0.10%(n=6)，相对峰面积的RSD<3.0%(n=6)，表明虎杖标准汤剂供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.7 样品检测与分析 分别取20批虎杖标准汤剂，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件分别测定，记录HPLC 图，生成对照图谱，见图3。将20批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，以HZBT180218色谱图为参照，采用中位数法，时间窗为0.1，进行相似度计算，见图4、表4。结果发现20 批虎杖标准汤剂与对照指纹图谱相似度均大于0.95，表明各批次虎杖标准汤剂具有较好的一致性。

2.虎杖苷；4.白藜芦醇；10.大黄素

2.虎杖苷；4.白藜芦醇；10.大黄素

图4 20批标准汤剂HPLC色谱

表4 20批标准汤剂指纹图谱相似度计算结果

3 讨论

3.1 虎杖样品来源

产区调查表明，虎杖药材现主产于四川、贵州、浙江、安徽、陕西等省。本研究收集了20批来自四川达州、南充、广安，浙江丽水，安徽安庆、池州，陕西汉中，贵州毕节、铜仁等多个省市的虎杖药材，产地来源基本覆盖了虎杖的传统产区、主产区和主要种植区，样品收集具有较强的代表性，能充分反映目前市场上的虎杖药材情况。

3.2 标准汤剂制备工艺的合理性

本研究中虎杖标准汤剂参照国家药典委员会公布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》和《医疗机构中药煎药室管理规范》中的相关规定，遵循中医药理论，按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，利用真空冷冻干燥设备进行干燥，制得干燥粉末，最大限度保存了水煎液中的成分，达到与传统汤剂基本一致。

3.3 标准汤剂的含量测定和指纹图谱分析

本研究建立的分析方法是采用同一个梯度洗脱系统，同时采集三个波长进行虎杖苷(306 nm)、大黄素(254 nm)和指纹图谱(280 nm)分析，该方法简便快捷，可应用于虎杖标准汤剂分析。

分析结果表明20批标汤中的虎杖苷含量远高于饮片，但大黄素含量远低于饮片，转移率虎杖苷可达30%以上，但大黄素不足4%；这应跟两成分的水溶性有关：虎杖苷微溶于水，而大黄素几乎不溶于水。20 批虎杖标准汤剂与对照指纹图谱相似度均在0.95以上，表明各批次虎杖标准汤剂具有较好的一致性，质量相对较稳定，说明本实验建立的虎杖饮片指纹图谱中10 个共有峰及对照指纹图谱可反映其指纹特征，具有鉴别评价意义。

3.4 标准汤剂的应用及意义

中药配方颗粒具有服用方便、易于携带、质量稳定等特点，这种新的饮片用药形式是对传统饮片的有益补充，但也存在标准不明确、剂量不统一、临床合理性有待进一步论证等各种问题。中药临床多为汤剂，汤剂也是我国传统医学中应用最早、目前临床应用最广泛的剂型，所以，亟需建立中药饮片标准汤剂用于标准化中药配方颗粒[9]。

本研究制备了 20批虎杖标准汤剂样品，并以虎杖苷、大黄素等有效成分为质控指标，结合指纹图谱对标准汤剂的化学成分进行整体把控，得到相关数据结果，该研究可以为虎杖配方颗粒质量标准的研究建立提供参考依据，保证成品与标准汤剂的质量一致性。