槟榔不同炮制品对斑马鱼急性毒性比较研究

林青华，屈文佳，秦华珍，贾 哲，徐新房，李向日，3*

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200；2.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；3.北京中医药大学 中药品质评价北京市重点实验室，北京102488；4.广西中医药大学广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200)

槟榔是棕榈科植物槟榔(ArecacatechuL.)的干燥成熟种子，其味苦、辛，性温，归胃、大肠经，具有杀虫、消积、行气、利水、截疟之功，用于绦虫病、蛔虫病、姜片虫病、虫积腹痛、里急后重、积滞泄痢、水肿脚气、疟疾的治疗[1]。槟榔常被炮制成生槟榔、炒槟榔或焦槟榔而用于临床。现代研究表明槟榔含有生物碱类、鞣质类、油脂类、黄酮类、三萜类和甾体类等多种化学成分，具有驱虫、助消化、抗氧化、抗抑郁等多种药理活性[2-3]。近年来，槟榔的毒理学研究结果表明其具有口腔毒性、肝毒性、心脏毒性、肾毒性等多种毒性反应[4-6]，但具体毒性成分仍未完全明确，且槟榔炮制品的毒性研究鲜有报道。因此，本文采用斑马鱼为试验对象，对生槟榔、炒槟榔和焦槟榔的急性毒性进行研究，以期为槟榔毒性成分的筛选提供参考。

1 材料与仪器

1.1 药材

生槟榔购于北京同仁堂药材有限责任公司，经北京中医药大学李向日教授鉴定为棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.成熟种子的炮制品；炒槟榔、焦槟榔为本实验室依照《中国药典》(2015年版)规定而炒制的合格炮制品。样品留样存放于北京中医药大学中药学院炮制教研室。

1.2 动物

AB型斑马鱼幼鱼(受精卵正常发育4天)由北京中医药大学中药学院提供，斑马鱼亲本购于中国科学院武汉水生生物研究所。

1.3 仪器与试剂

斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)；LRH-250 Z型恒温生化培养箱(广州沪瑞明仪器有限公司)；岛津LC-20 A高效液相色谱仪(LC-20 AD泵，SPD-20 A检测器，Lcsolution处理软件，岛津公司)；Ultimater ©XB-SCX色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm，月旭科技)；紫外-可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)；FA-1004电子分析天平(上海天平仪器厂)；SB 25-12 DTDN型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

没食子酸对照品(天津市光复精细化工研究所，批号20121107，纯度99.0%)；槟榔碱氢溴酸盐(批号1391，纯度>98.0%)购于上海施丹德生物技术有限公司，去甲基槟榔碱氢溴酸盐(批号Q-075-170930，纯度>98.0%)；槟榔次碱盐酸盐(批号B-084-170928，纯度>98.0%)购于成都瑞芬思生物科技有限公司；去甲基槟榔次碱盐酸盐(批号JS20171103，纯度>98.0%)购于湖北巨胜科技有限公司；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钙、盐酸、溴水、磷酸、氨水(北京化工厂)，碳酸钠、钨酸钠、硫酸锂(天津福晨化学试剂厂)，钼酸钠(天津市化学试剂四厂)，干酪素(北京奥博星生物技术有限责任公司)，以上试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 斑马鱼的养殖与繁育

2.1.1 斑马鱼胚胎培养液配制 按照Zebrafish Book标准，分别适量称取NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2，最终配成每升含0.14 moL NaCl、5.4 moL KCl、0.25 moL Na2HPO4、0.44 moL K2HPO4、1.3 moL CaCl2、1.0 moL MgSO4和4.2 moL NaHCO3水溶液，即得斑马鱼胚胎培养液。

2.1.2 斑马鱼的养殖及繁育 斑马鱼在循环养殖系统中驯养，其水温为(28±0.5) ℃，pH=7.0～7.2，电导率为450～550 μs/cm，每天黑暗环境(10 h)与光照环境(14 h)交替进行，以丰年虾幼虫喂食成年斑马鱼，每日3次。

暗周期开始前，将选取的雄性与雌性成年斑马鱼按照2∶1的比例放入产卵缸中，用隔板将其分开；暗周期结束后抽去隔板，雄鱼与雌鱼在光照刺激下完成交配，4 h后收集合格受精卵，将其用胚胎培养液清洗干净后转移到无菌培养皿中，置生化培养箱中孵育；每日上午更换胚胎培养液并及时除去死亡胚胎及胎衣，4天后选取发育正常的斑马鱼幼鱼进行急性毒性研究。

2.2 试药制备

称取生槟榔、炒槟榔和焦槟榔粉末(过80目筛)各20 g，分别置500 mL圆底烧瓶中，加10倍量去离子水，回流提取3次，每次1 h；分别合并提取液，减压浓缩，浓缩液水浴至流浸膏状，60 ℃减压干燥，分别得生槟榔、炒槟榔和焦槟榔提取物2.48 g、2.22 g和2.81 g，具体见表1。

表1 生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物的制备 (n=2)

2.3 试药中生物碱含量测定

按照本课题组确定的HPLC方法对生槟榔、炒槟榔和焦槟榔提取物中的生物碱进行含量测定。

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Ultimate XB-SCX (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-磷酸盐溶液(2 mL磷酸，2 mL氨水→1 000 mL)(72∶28)；检测波长为215 nm；柱温为35 ℃；进样体积10 μL；流速为1 mL/min。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取槟榔碱氢溴酸盐、去甲基槟榔碱氢溴酸盐、槟榔次碱盐酸盐和去甲基槟榔次碱盐酸盐6.40 mg、4.20 mg、3.37 mg和4.90 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加流动相溶解，定容，摇匀，得各对照品母液；精密移取各对照品母液1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL和2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，摇匀，得各对照品的单标溶液；精密移取各单标溶液1.0 mL、0.5 mL、0.5 mL、2.0 mL，置于相同的5 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 精密称取生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物12.7 mg、15.3 mg和14.1 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加流动相溶解，定容，摇匀，得各供试品母液；精密移取生槟榔、炒槟榔和焦槟榔母液各2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，摇匀，分别过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液，得各供试品溶液。

2.3.4 供试品的测定及含量计算 采用上述HPLC方法分别对供试品和对照品进行检测，各样品平行检测2次。通过外标一点法计算各供试品中生物碱的含量，具体计算公式为：槟榔碱重量=氢溴酸槟榔碱重量/1.521 4，去甲基槟榔碱重量=去甲基槟榔碱氢溴酸/1.573 2，槟榔次碱重量=盐酸槟榔次碱/1.258 3，去甲基槟榔次碱重量=盐酸去甲基槟榔次碱重量/1.286 7。具体结果见表2。

表2 生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物中生物碱的含量 (n=2)

2.4 试药中鞣质的含量测定

各供试品中鞣质的含量测定方法参照2015版《中国药典》(四部)中“2202 鞣质含量测定法”项下规定内容进行检测，具体结果见表3。

表3 生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物中总鞣质的含量 (n=2)

2.5 试药对斑马鱼的急性毒性试验

2.5.1 供试液制备 精密称取生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物各0.200 8 g，0.200 4 g和0.200 4 g，分别加50 mL胚胎培养液，超声溶解，制得浓度为4 000 μg/mL的生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物母液，分装，冻存，用时根据所需浓度稀释即得供试液。

2.5.2 急性毒性研究 选取发育正常的斑马鱼幼鱼置于12孔板中，每孔20条，置于培养箱中培养24 h，次日吸弃各孔培养液，加入4 mL不同浓度的各炮制品供试液，置于培养箱培养24 h，次日统计斑马鱼死亡情况并计算半数致死浓度(LC50)，每个浓度设3个复孔。结果具体见表4。

表4 生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物对斑马鱼幼鱼的LC50 (μg/mL)

注：采用SPSS 17.0统计软件中的机率单位加权回归法(Bliss法) 计算LC50。

3 讨论

斑马鱼为鲤科短担尼鱼属的一种硬骨鱼，其基因与人类相似度达87%，且对药物的反应与人的临床反应类似，并具有个体小、繁殖量大、实验周期短等优势，现已成为毒理学评价中重要的模型动物[7-8]。研究表明生物碱类和鞣质类成分是槟榔的主要成分也是毒性成分[9]，且槟榔经炮制后两者的含量会发生相应变化。因此，对生槟榔、炒槟榔和焦槟榔的急性毒性进行研究，既可以通过其LC50值比较槟榔不同炮制品的毒性大小，又可以结合其生物碱和鞣质的含量为槟榔毒性成分的初步筛选提供参考。

槟榔不同炮制品的提取结果(表1)表明，焦槟榔的提取率(14.03%)较生槟榔(12.39%)和炒槟榔(11.08%)高，这可能与焦槟榔经武火炒制后饮片坚硬度降低而利于成分溶出有关。生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物中总生物碱的含量分别为3.24%、2.56%和2.07%(表2)，说明槟榔各炮制品中生物碱的总量随着炒制温度的升高而降低，这可能与槟榔中小分子生物碱类成分易挥发有关；而其总鞣质的含量分别为22.72%、26.68%和18.28%(表3)，说明槟榔中鞣质类成分的含量随着炒制温度的升高呈现先上升后下降的趋势，与文献报道的结果相一致[10]。

槟榔各炮制品对斑马鱼急性毒性的试验结果表明，生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物对斑马鱼的LC50值分别为29.74 μg/mL、32.47 μg/mL和40.03 μg/mL(表4)，说明生槟榔经不同的温度炒制后毒性降低，符合中药“炮制减毒”的基本理论。当槟榔各炮制品在LC50值时，生槟榔、炒槟榔、焦槟榔中总生物碱的含量分别为0.964 μg/mL、0.831 μg/mL和0.829 μg/mL，呈现毒性越大生物碱含量越高的趋势，提示生物碱类成分可能是槟榔中的毒性成分，这也与文献报道相一致[9]；而生槟榔、炒槟榔和焦槟榔总鞣质的含量分别为6.76 μg/mL、8.66 μg/mL和7.32 μg/mL，与其LC50值不呈量效关系，但文献报道槟榔中的鞣质类成分具有毒性甚至致癌性，因此槟榔鞣质类成分的毒性仍需要进一步研究。此外，槟榔各炮制品对斑马鱼LC50值是否完全取决于生物碱、鞣质类成分的含量仍有待于研究。

综上所述，采用斑马鱼为试验对象对槟榔炮制品的急性毒性研究结果表明生槟榔、炒槟榔和焦槟榔水提物对斑马鱼的LC50值分别为29.74 μg/mL、32.47 μg/mL和40.03 μg/mL，符合中药炮制减毒的基本理论，并推测生物碱类成分可能是生槟榔的毒性成分，而槟榔中鞣质类成分的毒性仍有待于进一步研究。