原子转移自由基聚合调控制备两亲性嵌段共聚物纳米胶束及其载药性能

吴梓斌 ，徐德忠 ，冷 欣 ，苗庆显 ，肖旺钏 ，2

（1.福建农林大学 材料工程学院，福建 福州350108；2.三明学院 资源与化工学院，福建 三明365004）

两亲性嵌段共聚物组装形成的胶束应用于多种药物的负载，是最有发展和应用前景的纳米载体材料之一[1]。嵌段共聚物是利用有机化学和高分子化学合成的手段将两种或几种不同性质的单体或聚合物链接起来，形成一种新的高分子聚合物，从而获得更好的性能的材料。两亲性的高分子链段同时包含亲水和疏水两种化学结构，对油相和水相都具有很好的亲和性，同时还具有高分子的增黏性和低分子的表面活性[2-3]。两亲性嵌段共聚物在油相溶液和水溶液中均会进行不同自组装以使其适应当下的环境。在水溶液中，疏水性链段会尽可能减少与水溶液的接触面积而团聚收缩形成类似于核结构，亲水性链段则会尽可能增大与水溶液接触面积而伸展形成类似壳结构，此为水溶液中两亲性胶束的自组装形态。这种能自组装为核-壳结构的聚合物胶束在难溶性药物的递送及药物定位控制释放[4]、基因治疗[5]、蛋白质分离与提取[6]、生物智能响应性传感器[7]、诊断治疗疾病[8]等领域具有非常好的应用前景。在药物递送方面，胶束载体的大小通常为十分之几到几百纳米，以允许全身（静脉内）或局部（粘膜）给药，并促进它们在细胞内扩散。此外，胶束的表面功能改性可以赋予纳米载体控制其药代动力学和生物分布的能力，尽可能提高药物在体内的循环时间。

在药物递送研究领域，聚合物胶束由于其多样性，譬如能够增溶难溶性的药物、减少药物被肾滤系统清除、药物缓慢释放、减少药物的毒副作用、药物靶向递送、提高药物在体内的循环时间等，倍受专家学者的研究和开发[9-11]。智能两亲性嵌段聚合物胶束会在特定的外界环境下表现出不同的响应性[12]，主要有以下响应，pH敏感[13-14]，温度敏感[15]、光敏感[16]等。pH敏感型是指在某一pH值范围之内，链段的结构会发生了某种转变的过程[17]。栾淑娟等制备合成mPEG-Hz-PLA嵌段共聚物，聚合物胶束能自组装成具有核-壳结构的纳米胶束。进一步研究了该聚合物的载药能力和在不同pH值条件下药物释放的能力，以验证其pH响应性[18]。温度敏感型是指当在特定温度发生变化时，聚合物某一链段从溶解到不溶解或者从不溶解到溶解以便药物进行释放[19]。郭莉等[20]以聚异丙基丙烯酰胺作为温度敏感段、以聚丙烯酸作为pH敏感段成功制备了双重敏感性的两亲性嵌段共聚物。该聚合物成功负载了抗癌药物紫杉醇(PTX)，并进一步探究了载药胶束在人体环境中的控释行为。光度敏感性共聚物指在共聚物中含有感光性的链段，该感光链段在吸收光源之后，对该链段产生物理或者化学的变化，自行组装的纳米胶束结构发生转变，使之对于药物的负载更加的高效[21]。赵发宝等[22]以溴封端聚乙二醇单甲醚(mPEG-Br)为大分子引发剂，通过原子转移自由基聚合 (ATRP)反应制备了不同嵌段比例且分子量分布较窄的光学活性聚乙二醇单甲醚嵌段聚(N-甲基丙烯酰-L-亮氨酸甲酯)(mPEG-b-PMALM)聚合物。就当前的研究情况分析，在响应性药物靶向传递和可控释放领域内，pH响应性由于其特点引起了研究者的广泛研究[23]。当聚合物胶束从血液进入到肿瘤细胞中，pH环境生变化会引起pH敏感的聚合物胶束发生变化，从而胶束解离，药物释放。聚酯类材料在人体内的降解性良好，且生物的降解性也很好，在人体内最终可以降解成二氧化碳和水，从而排出体外[24]。基于以上科学问题，本文拟设计一种低成本、合成工艺简单且所得粒径便于调控的新型两亲性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA。甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PPEGMA）是作为该共聚物的亲水嵌段，其具有无免疫原性及抗原性、无毒无害、能与众多溶剂互溶、不易被蛋白质和血小板吸附等优点。甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA）最为该共聚物的疏水嵌段，具有良好的生物相容性、价格低廉等优点，且因其反应活性高、疏水性强广泛应用于制备功能化微球和嵌段共聚物。因此本文采用两步再生电子转移生成催化剂原子转移自由基聚合（ARGET ATRP）反应制备该两亲性嵌段共聚物。第一步ARGET ATRP反应是使用2-溴异丁酸乙酯作为引发剂对甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PEGMA）进行修饰，并使单体（PEGMA）发生自聚，目的在其链段端引入溴原子得到具备引发功能的亲水链段PPEGMA-Br；第二步ARGET ATRP反应是通过大分子引发剂PPEGMA-Br引发甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA）聚合，从而得到两亲性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA，并对其进行结构的表征和药物包埋、药物控制释放性能的测试。

1 实验部分

1.1 药品和仪器

1．1．1 药品

甲基丙烯酸聚乙二醇酯（99%），甲基丙烯酸叔丁酯（99%），溴化铜（99%），2-溴异丁酸乙酯（99%），苯甲醚（99.7%），三(2-吡啶甲基)胺（98%），丙酮（98%），正己烷（97%），异辛酸亚锡（95%），盐酸阿霉素（DOX）（99%），中性氧化铝，以上试剂购买自阿拉丁，直接使用。

1．1．2 仪器

实验所用仪器见表1。

表1 实验中所用主要检测仪器

1.2 实验步骤

1．2．1 具有引发功能的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PPEGMA-Br）的合成

用电子天平称取约4.6 mg三 (2-吡啶甲基)胺、3.6 mg溴化铜、3.84 g甲基丙烯酸聚乙二醇酯、31.2 mg 2-溴异丁酸乙酯和15 mL溶剂苯甲醚置于100 mL两口烧瓶中，并将烧瓶置于超声波清洗器中超声分散。待溴化铜充分分散，将两口烧瓶置于40℃的油浴锅内，并用反口塞密封两口烧瓶。利用长针头持续往两口烧瓶内注入高纯氮气，同时利用短针头保持两口烧瓶内气压与大气压平衡。在另一个瓶子中加入160 μL异辛酸亚锡和3 mL苯甲醚，并注入氮气进行保护，防止其氧化。待两口烧瓶内的反应持续45 min时，把瓶内的异辛酸亚锡和苯甲醚混合液体注入两口烧瓶中，并保持高纯氮气的持续注入。反应24 h，待冷却后，将所得的反应产物逐滴加入到过量且快速搅拌的正己烷中，静置后倒掉上清液，所得沉淀即为聚合物粗产物。进一步用过柱的办法除去聚合物粗产物中的溴化铜，在玻璃柱中加入适量的中性氧化铝，所得的聚合物粗产物用少量的丙酮溶解后，加入到玻璃柱中，用丙酮作为洗脱剂进行洗脱。过柱所得的液体用旋转蒸发仪进行蒸发浓缩，再次逐滴滴入过量正己烷中，所得沉淀用真空干燥箱干燥24 h待用。干燥后的固体即为PPEGMA-Br。

1．2．2 甲基丙烯酸聚乙二醇酯-甲基丙烯酸叔丁酯（PPEGMA-b-PtBMA）嵌段共聚物的合成

称取 1 mmol的 PPEGMA-Br、0.05 mmol的溴化铜、0.05 mmol的三(2-吡啶甲基)胺、20 mmol的甲基丙烯酸叔丁酯和15 mL溶剂苯甲醚置于两口烧瓶中。反应步骤与上述步骤大致相同。将两口烧瓶置于40℃的油浴锅内搅拌45 min后，保持高纯氮气的持续注入条件下，快速注入0.5 mmol异辛酸亚锡和3 mL苯甲醚的混合物，持续反应24 h。待冷却后，将所得的反应产物逐滴加入到过量且快速搅拌的正己烷中，静置后倒掉上清液，所得沉淀即为聚合物粗产物。进一步用过柱的办法除去聚合物粗产物中的溴化铜，在玻璃柱中加入适量的中性氧化铝，所得的聚合物粗产物用少量的丙酮溶解后，加入到玻璃柱中，用丙酮作为洗脱剂进行洗脱。过柱所得的液体用旋转蒸发仪进行蒸发浓缩，再次逐滴滴入过量正己烷中，所得沉淀用真空干燥箱干燥24 h待用。所得的产物即为两亲性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA。

1．2．3 临界胶束浓度（CMC）测定

近年来，快速发展的荧光探针技术是研究胶束体系的重要手段，其中最为常见的是以芘为荧光探针。首先，称量芘2.4 mg溶于1 000 mL的甲醇，配置成1.2×10-5mol/L芘的甲醇溶液待用。将10 mg聚合物溶于少量丙酮中，再往里加入10 mL超纯水，慢速搅拌24 h（挥发丙酮），从而获得1 mg/mL的聚合物母液。随后将母液稀释成 5×10-1、2.5×10-1、1×10-1、7.5×10-2、5×10-2、2.5×10-2、1×10-2、7.5×10-3、5×10-3、2.5×10-3、1×10-3、7.5×10-4、5×10-4、2.5×10-4、1×10-4mg/mL 一系列浓度。 取 0.5 mL 芘的甲醇溶液置于相应数量的试样瓶中，随即伴随着晃动试样瓶通氮气将甲醇吹干。往含芘的试样瓶中加入10 mL聚合物的稀释液超声1 h并避光平衡24 h后进行测试。芘在样品溶液中的浓度为6×10-7mol/L。用荧光分光光度计测试溶液的荧光激发光谱，对激发波长为337和335 nm数据进行记录，以二者的比值为纵坐标，聚合物浓度求对数后数值为横坐标作图。

1．2．4 PPEGMA-b-PtBMA空白胶束以及载DOX胶束的制备

通过透析方法形成空白的聚合物胶束。将20 mgPPEGMA-b-PtBMA完全溶于5 mL丙酮中迅速搅拌5 h，然后超声0.5 h。随后，在剧烈搅拌下，以10 μL/s的速度向溶液中加入10 mL去离子水。将所得的溶液转移至分子截留酯为8 000～12 000的透析24 h。在透析前6 h中每2 h更换一次去离子水，然后每6小时更换一次。 最后，将溶液冷冻干燥48 h得到固体产物，即为PPEGMA-b-PtBMA空白胶束。

载药胶束的制备方法与上述方法相似。称取2 mg盐酸阿霉素置于小瓶，并用1 mL丙酮使其完全溶解。将20 mg PPEGMA-b-PtBMA完全溶于5 mL丙酮中迅速搅拌5 h，然后超声0.5 h。随后将盐酸阿霉素的丙酮溶液加入至聚合物溶液剧烈搅拌，再以10 μL/s的速度向溶液中加入10 mL去离子水。 滴加结束后在避光的条件下将聚合物溶液转移透析袋 （相对分子量分子量截留值为 8 000～12 000）中，用去离子水透析24 h。在透析前6 h中每 2 h更换一次去离子水，然后每6 h更换一次。 最后，将溶液冷冻干燥48 h得到固体产物，即为PPEGMA-b-PtBMA载DOX胶束。

1．2．5 载药量和包封率的测定

将5 mg盐酸阿霉素（DOX）溶解于5 mL丙酮中，配置成1 mg/mL的母液。随后将母液配置成0.75、 0.50、0.25、0.10、0.075、0.05、0.025、0.01 mg/mL 一系列浓度。 用紫外分光光度计检测其 485 nm处的吸光度，并绘制盐酸阿霉素/丙酮的标准曲线。

将1 mg所制备的PPEGMA-b-PtBMA载药胶束溶解于10 mL的丙酮中，使胶束形态发生变化（亲水段为核，疏水段为壳），所载DOX溶解于丙酮中，随后用紫外分光光度计检测其485 nm处的吸光度，对比盐酸阿霉素/丙酮的标准曲线，计算胶束的载药量（LC）及包封率（EE）。

1．2．6 DOX 的体外释放

用紫外/可见分光光度计来模拟计算载药胶束的药物释放。具体方法如下，将一定量的载药胶束装入透析袋中，放入50 mL的释放介质在37℃的条件下进行透析。释放介质分别为0.1 mol/L，pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液和 0.1 mol/L，pH=4.0 的磷酸盐缓冲溶液。分别在时间为 0.5、1、3、6、9、12、24 h分别取样3 mL，每次取样后补充3 mL新鲜的释放介质。随后用紫外分光光度计测其吸光度并计算出盐酸阿霉素的浓度。

1.3 测试表征

（1）核磁共振表征：使用氘代氯仿（CDCl3-d）作为溶剂，四甲基硅烷（TMS）作为内标，对聚合物的化学结构进行核磁共振检测（1H-NMR，Bruker AVANCEⅢ 400）。

（2）粒径分布测定：样品的尺寸大小及分布采用英国马尔文激光粒度仪Zetasizer Nano-ZS进行测定，分析空白胶束及载药胶束的粒径分布情况，并与透射电镜观察的胶束粒径进行对比。

（3）透射电镜分析：称取一定量聚合物空白胶束及载药胶束滴在铜网上，待其干燥后采用JEM-1010透射电镜对其进行粒径和形貌观察。

（4）紫外/可见分光吸光度测试：测定波长为485 nm。

2 结果与讨论

2.1 PPEGMA-b-PtBMA的合成

为了构建一种两亲性pH敏感的两嵌段聚合物胶束作为药物输送载体，本文采用的ARGET ATRP法可获得一种A-B型高分子PPEGMA-b-PtBMA，同时研究聚合物的载药量、pH敏感性以及药物释放的情况。首先，在苯甲醚溶剂中，以三(2-吡啶甲基)胺/溴化铜为催化体系，异辛酸亚锡作为还原剂，2-溴异丁酸乙酯作为配体，以甲基丙烯酸聚乙二醇酯作为单体，用AGGET ATRP方法自聚，调控亲水端的分子量的同时并引入了端基溴原子得到具有引发功能的大分子引发剂PPEGMA-Br，合成路线如图1。然后对所得的大分子引发剂，再次使用AGGET ATRP方法接枝甲基丙烯酸叔丁酯，经提纯后即得聚合物PPEGMA-b-PtBMA。

图1 PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA合成示意图

为了进一步表征聚合物结构，以CDCl3为溶剂，采用核磁共振谱仪测定聚合PPEGMA-Br和PPEGMA-b-PtBMA的核磁氢谱。图2为PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA的1H-NMR谱图。从PPEGMA-Br的1H-NMR谱图可见，化学位移为3.7（b）处是PEGMA链节上两类亚甲基氢质子化学位移峰，在1.95（a）处是PEGMA以2-溴异丁酸乙酯为引发剂自聚后引入的异丙基的氢质子峰。经过ARGET ATPR反应后，PPEGMA-b-PtBMA的谱图中1.42（c）处出现叔丁基上的氢质子峰。因此，可以判定两亲性聚合物PPEGMA-b-PtBMA成功合成。

图2 PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA的核磁共振氢谱图

2.2 临界胶束浓度的测定

在药物输送的领域内，临界胶束浓度是一个极其重要的指标，用于评估聚合物胶束在体内的稳定程度。芘溶液的荧光光谱包含一个振动带，对芘环境的极性具有很高的灵敏度。当胶束形成时，芘分子最好位于胶束的疏水核心内或靠近其疏水核心，从而改变其光物理特性。以芘的荧光探针法测定PPEGMA-b-PtBMA聚合物自组装成胶束的临界胶束浓度。随着PPEGMA-b-PtBMA浓度增加，芘的激发光谱强度不断增加且第三个峰的位置发生化学位移，逐渐从335 nm转移到337 nm。以I337和I335的比值为纵坐标、浓度对数为横坐标作图。从图3可见，I337/I335急剧增加的转折点即为聚合物的CMC值。PPEGMA-b-PtBMA的CMC值为5.0 mg/L。研究表明，随着聚合物疏水嵌段的增长，在水溶液中，其自组装为胶束的能力越强。本文所合成的PPEGMA-b-PtBMA聚合物具有较低的临界胶束浓度，表明其水溶液的核-壳结构相对稳定，即使浓度较低，亦能保持完整结构，有利于增长其在人体内的循环时间。

图3 PPEGMA-b-PtBMA的临界胶束浓度图

2.3 载药胶束的制备与表征

由于PPEGMA-b-PtBMA具有优异的两亲性能，可在水溶液中自组装形成稳定的胶束结构。亲水性的PPEGMA链段作为胶束的外壳，疏水性的PtBMA链段作为胶束的内核，使得该聚合物形成具有壳核结构的冠状胶束。采用透析法制备PPEGMA-b-PtBMA载药胶束。经紫外/可见分光光度计表征载药胶束的丙酮溶液，计算得知PPEGMA-b-PtBMA的载药量（LC）为4.1%，包封率（EE）为63%，表明该聚合物胶束能有效包裹疏水性药物。

利用动态光散射测试了PPEGMA-b-PtBMA组装胶束的尺寸及其分布范围。对于PPEGMA-b-PtBMA所形成的胶束，未载药前胶束的直径大约为130 nm，载药后胶束的平均直径约210 nm，如图4。就载药前后胶束的粒径进行对比，载DOX后粒径明显增大，表明胶束空腔内能包裹一定量的DOX。

采用透射电子显微镜（TEM）对胶束的形貌进行观察，从PPEGMA-b-PtBMA载DOX胶束的TEM图像（图5）可以观察到，载药胶束总体呈球形，尺寸大约为200 nm。可见，TEM表征结果大概与动态光散射的粒径表征一致。

图4 PPEGMA-b-PtBMA胶束的粒径分布

2.4 DOX的体外释放性能研究

DOX的体外释放行为以pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液和pH=4.0的磷酸盐缓冲溶液作为释放介质，在37℃模拟体温下进行。从图6可见，在酸性条件下，DOX的释放率较快，24 h的药物释放量可达76%。而在中性环境下，DOX的释放速率明显减慢，24 h的释放率仅为37%。由于载药胶束在不同pH环境下其药物释放量差距较大，初步推断此聚合物胶束具有pH敏感性。在pH=7.4的环境下（相当于人体的正常体内环境），药物的释放缓慢，有利于药物在体内的循环，降低药物的使用剂量，减少药物对人体的副作用。而在pH=4.0的环境下（相当于人体肿瘤部位的所处环境），药物快速释放，有利于在短时间内作用于病患位置，减少治疗时间。

图5 PPEGMA-b-PtBMA载DOX胶束的TEM图像

图5 PPEGMA-b-PtBMA载DOX胶束的体外释放曲线

3 结论

本文通过设计合成一种pH响应两亲性两嵌段的聚合物PPEGMA-b-PtBMA，使其在水溶液中发生自组装成核-壳结构，并进一步研究其载药及药物释放性能，认定该聚合物符合难溶性药物递送的用途。通过原子转移自由基聚合（ARGET ATRP）合成了该嵌段共聚物，并用核磁共振对聚合物的化学结构进行了表征。使用荧光探针技术计算其CMC非常低，说明胶束稳定性良好。采用透析法制备PPEGMA-b-PtBMA空白及载药胶束，并使用透射电镜、激光粒度仪观测胶束的粒径大小及形貌，空白胶束粒径大约130 nm，载药胶束粒径大约210 nm，形状为球形。载药胶束具有pH敏感性，在pH值4.0条件下的释放速率明显高于pH值7.4条件下的释放速率，说明该胶束可快速作用于病患位置。这种粒径小，具有pH敏感性，通过活性基聚合，生物降解性良好的纳米级载药胶束，为研发新一代的纳米级载药胶束提供了理论基础及技术指导。