草珊瑚粗多糖对运动性骨骼肌损伤(EIMD)的干预效果及机制

2020-05-11侯改霞刘艳秋

三明学院学报 2020年2期

王勇，侯改霞，刘艳秋

（1.三明学院体育与康养学院，福建三明 365004；2.河南大学体育学院，河南开封475001）

草珊瑚是我国传统的中药，学名Sarcandra glabra(Thunb).Nakai，金粟兰科草珊瑚属多年生常绿亚灌木，《中国药典》记载其性味苦辛、平，具清热凉血、活血消斑、祛风通络等功能。现代药理学研究表明[1-2]，草珊瑚具有抗菌消炎、免疫调节、祛风活血、消肿止痛、促进骨折愈合等多种药理作用。刘艳秋[3]研究认为草珊瑚多糖有防止细胞凋亡、抗氧化、改善应激负荷大鼠的免疫功能及抗疲劳作用，谢勇[4]研究认为草珊瑚多糖是草珊瑚抗炎作用的主要活性部位。本研究通过大鼠大强度离心运动训练，观察骨骼肌组织出现的损伤特征及炎症因子NLRP3、IL-18和IL-1β的表达情况，为进一步研究大强度离心运动对骨骼肌细胞所形成的损伤现象，并探讨伴随的炎症反应过程及草珊瑚粗多糖对炎症反应因子表达的抑制效果。

长时间大强度运动后会引起骨骼肌超微结构发生损伤性变化出现运动性骨骼肌损伤(exerciseinduced muscle damage，EIMD)，徐飞[5]研究认为大强度离心运动造成肌纤维微损伤和延迟性肌肉酸痛是EIMD的主要症状，后者可导致机体运动能力显著降低，严重影响运动训练和比赛。关于EIMD的发生机制国内外学者进行大量的研究，主要包括机械牵拉学说、代谢学说、炎症反应学说等,有研究认为[6]代谢因素可能是EIMD发生中心环节，包括肌糖原的耗竭与再生障碍、氧化应激增强、离子代谢紊乱等。本研究主要从EIMD发生的代谢因素角度出发，旨在观察草珊瑚粗多糖对减轻和延缓EIMD症状及其修复效果，为运动营养补剂提供参考依据。

研究［7］认为，运动训练后肌肉损伤伴随着炎症反应、氧化应激过程，而该过程也是肌纤维重塑及功能强化的必经过程，是伴随运动训练出现的常见现象。骨骼肌细胞在大强度离心运动时由于大强度牵拉肌细胞，骨骼肌出现运动性损伤（EIMD）,肌纤维结构遭到破坏、变性、坏死、血肿现象明显，损伤后继发炎症细胞和致炎因子浸润至损伤部位，发生炎症反应，将直接影响到运动者的体育锻炼与运动训练水平的提高。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物

实验使用成年健康雄性SD大鼠，24只，SPF级，体重250～300 g,购自北京斯贝福生物技术有限公司，大鼠随机分为损伤组（M）、自然恢复组（N）、草珊瑚干预组（S），另增设安静对照组（C），每组6只。

1.1.2 实验材料

草珊瑚多糖的提取采用邵佳等[8]的提取工艺，将全草经粉碎-乙醇浸提-烘干-水浴浸提-醇析等过程提取得草珊瑚粗多糖，草珊瑚是由福建省三明市草珊瑚国家种植基地提供。

1.2 动物模型

在实验过程中大鼠饲养环境室温(24±3)℃、湿度 45%～60%，自由饮水和进食,采用自然光照。运动造模方案：采用四周连续下坡跑离心运动，跑台坡度设为-16°，每周运动5 d。

表1 大鼠大强度离心运动运动方案

1.3 实验取材

最后一次离心运动结束24 h后，安静对照组（C）与损伤组（M）大鼠采用腹腔内注射2.5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血，取材。自然恢复组（N）采用自然恢复7 d，草珊瑚干预组（S）按大鼠体重210(mg/kg)·(BW/d)灌胃给药，共7 d。自然恢复组（N）和草珊瑚干预组（S）大鼠在最后一次给药后，大鼠过夜禁食12 h后，称重后腹腔麻醉，剖腹，腹主动脉采血，取材。

1.4 测试指标与方法

1.4.1 指标测试

乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，ELISA试剂盒购自e Bioscience，反转录试剂盒购自Thermo，实验严格按试剂盒说明操作。

1.4.2 RNA提取及q PCR检测mRNA表达

Trizol提取大鼠股四头肌总RNA。取2 μg RNA经反转录试剂盒进行cDNA合成。根据说明书利用PCR试剂盒进行Real-time PCR系统检测，每个样本设3组独立重复实验。实验所用引物序列见表 2。

表2引物经武汉赛维尔生物科技有限公司合成后按照Bio-Rad的SYBR体系进行 qPCR扩增，PCR产物经过溶解曲线检验，将目的基因扩增产物与内参基因βactin 进行比较，经 2-ΔΔct方法计算出该基因信使 RNA (messenger RNA，mRNA)的相对表达量。

1.4.3 电镜标本制备与图片

取经固定的大鼠比目鱼肌，经漂洗-后固定-脱水-渗透-包埋-染色等步骤处理，经透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

表2 人相关基因的引物序列

1.5 统计学处理

实验结果用GraphPad Prism 5.0和SPSS 22.0进行处理，结果以平均数±标准差表示，数据进行组间t-检验，显著性差异以 P＜0.05和 P＜0.01表示。

2 实验结果

2.1 不同组别大鼠骨骼肌电镜观察

通过对骨骼肌组织电镜（图1）观察，从肌原纤维、肌小节的排列状况，肌节中I带和A带的完整性以及Z线的变化情况等指标进行分析。可见C组中的肌原纤维排列整齐，肌节、Z线清晰排列整齐；从M组则可明显观察到肌原纤维与肌节紊乱，肌节参差不齐，肌丝排列改变、粗肌丝相互位置紊乱、部分肌丝断裂或消失，Z线出现异常包括Z带扭曲、Z线波形变化；N组可见有一定修复与改善，肌原纤维肌节与Z线结构等得到一定程度上的修复改善；S组则基本修复正常，肌原纤维、肌节排列、Z线结构基本正常。

图1 不同组别大鼠骨骼肌电镜观察（×6000）

2.2 草珊瑚多糖对大强度离心运动大鼠血清CK、LDH活性的影响

由表3和图2均可以看出大强度离心运动后M组和N组血清中CK、LDH的活性出现明显升高，分别具有显著性（P＜0.05）和极显著性（P＜0.01）；而S组血清中CK活性比M组、N组有显著性降低分别具有显著性（P＜0.05）和极显著性（P＜0.01），与安静对照组相比无显著变化；S组血清中LDH活性比M组和N组均有显著性下降（P＜0.05），与N组相比无明显变化。可以看出大强度离心运动后大鼠血清中的CK、LDH的活性有显著性提高，表明大强度离心运动后骨骼肌出现的EIMD导致CK和LDH活性增加，草珊瑚多糖干预后的CK、LDH活性得到良好的影响，活性明显低于M组，提示草珊瑚多糖对大强度离心运动后的骨骼肌EIMD具有良好的干预效果，对骨骼肌后续的修复起到重要意义。

表3 草珊瑚粗多糖对大鼠血液CK、LDH的活性影响

图2 大强度离心运动后大鼠骨骼肌血清CK、LDH的活性变化

2.3 草珊瑚多糖对大强度离心运动大鼠血清TNF-α含量的影响

由表4和图3可以看出大强度离心运动后大鼠血清中TNF-α含量的变化，与安静对照组相比，各组大鼠血清中TNF-α含量均有显著性升高分别为P＜0.05和 P＜0.01；草珊瑚干预组与运动损伤组和自然恢复组相比大鼠血清中TNF-α含量有明显下降分别为P＜0.05和 P＜0.01。大强度离心运动后大鼠血清中TNF-α含量的变化，表明大强度离心运动后机体存在明显的炎症反应过程，而草珊瑚多糖干预后的大鼠血清中TNF-α含量明显低于自然恢复组，提示草珊瑚多糖具有良好的抗炎消炎，保护骨骼肌组织的效果。

表4 草珊瑚粗多糖对大鼠血清中TNF-α含量的变化

图3 大强度离心运动后大鼠血清中TNF-α的含量变化

2.4 大强度离心运动后大鼠骨骼肌IL-1β、IL-18基因的表达

表5和图4可以看出，因大强度离心运动后所致EIMD，伴随炎症反应的IL-1β、IL-18在骨骼肌中的表达水平升高。与安静对照组相比，M组和N组的大鼠骨骼肌中的IL-1β、IL-18表达水平升高，具有极显著性（P＜0.01）；S组与M组和N组相比，S组的骨骼肌中IL-1β、IL-18的表达水平均有明显下降，具有显著性（P＜0.05），其中S组和M组中IL-18的表达水平具有极显著性差异（P＜0.01）。可以看出大强度离心运动后大鼠骨骼肌因EIMD的原因，IL-1β、IL-18蛋白表达水平均有显著性提高，表明组织中存在明显的炎症反应过程，而草珊瑚多糖具有良好的抑制二者表达。

表5 大强度离心运动后大鼠骨骼肌IL-1β、IL-18基因的表达

图4 大强度离心运动后大鼠骨骼肌IL-1β、IL-18的表达

3 结果与讨论

3.1 大强度离心运动致EIMD微观结构变化

研究[9]表明，大强度离心运动可对骨骼肌细胞产生显著的刺激，更易出现运动性的肌损伤EIMD，这种运动损伤常见于人们体育锻炼和运动训练中，而骨骼肌损伤后局部将出现肌纤维结构破坏、变性、坏死、血肿[10],之后炎症细胞和致炎因子浸润至损伤部位，发生炎症反应。虽然随后的肌肉会发生再生修复，但炎症反应将直接影响到运动者的运动训练的过程及水平。有研究认为运动训练过程中肌肉损伤和炎症发生是骨骼肌收缩导致肌节重塑及功能强化的的必经过程，是伴随运动训练出现的常见生理现象[11]。研究发现，大强度离心运动后大鼠骨骼肌组织电镜中可明显观察到肌原纤维与肌节紊乱，肌节参差不齐，肌丝排列改变、粗肌丝相互位置紊乱、部分肌丝断裂或消失，Z线出现异常包括Z带扭曲、Z线波形变化；通过一周自然修复，可见肌原纤维肌节与Z线结构等到一定程度上的修复改善。大量研究显示骨骼肌在离心运动后出现包括肌丝紊乱、排列不规则、Z带扭曲及细胞浆Ca2+代谢紊乱等[12-14]，与本实验结果相符。

本研究认为由于肌细胞受到大强度张力下将激活钙蛋白酶水解过程,致使肌节被拆解成有利于修复损伤的蛋白或合成新的蛋白并进行重塑，而肌节拆卸和重塑过程必然经历了肌肉损伤和炎性细胞浸润过程。本研究中发现草珊瑚粗多糖干预下的大鼠骨骼肌肌原纤维、肌节排列、Z线结构得到较好的修复效果，干预途径与草珊瑚粗多糖较好的抗炎、消炎活性效果相关，能有效改善骨骼肌细胞损伤后的炎性反应过程，从而有效促进骨骼肌细胞微结构的修复过程。

3.2 EIMD对血清中CK、LDH的影响

肌酸激酶(CK)属于能量代谢酶,作为大分子蛋白主要存在骨骼肌与心肌等组织细胞内，乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解通路中的主要酶，可催化乳酸→丙酮酸转换过程。研究认为，血清CK和LDH的活性是评价骨骼肌的损伤状况的敏感指标，EIMD后血清中CK、LDH活性可显著增加，血清CK和LDH活性越高，核磁共振成像（MRI）信号越强，骨骼肌机械损伤越严重［15］。马新东等［16］通过一次性间歇离心运动模型来观察大鼠骨骼肌骨架蛋白的变化，发现运动后大鼠血清CK及LDH活性非常显著高于安静对照组水平，随后逐渐下降。文中研究结果显示大强度离心运动致骨骼肌出现EIMD，导致血清中的CK、LDH的活性水平有显著性提高，而草珊瑚粗多糖干预能有效降低血清中CK、LDH的活性，提示草珊瑚粗多糖对大强度离心运动后的骨骼肌EIMD具有良好的干预效果，对骨骼肌细胞的修复和重塑起到了重要意义，有效改善了骨骼肌细胞修复的过程。

3.3 EIMD对TNF-α、IL-1β、IL-18等致炎因子的影响

研究认为，免疫反应与炎症反应两种反应过程与内环境关联密切，其中白细胞介素、肿瘤坏死因子超家族、生长因子等细胞因子对两种反应过程具有重要意义[17]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)具有诱导细胞凋亡、坏死及激活淋巴细胞因子等多种抗肿瘤活性，发挥抗肿瘤免疫调节功能［18-19］,在机体受到刺激时，巨噬细胞会迅速释放TNF-α和IL-1β等细胞因子，参与免疫调节作用。通常较低浓度的TNF-α，可在一定程度上能保护机体，而高浓度则是重要的促炎症递质，可介导炎症反应的许多病理过程，使机体器官甚至系统多处受损[20]，研究中显示TNF-α在大强度离心运动后血清中浓度显著性增加，草珊瑚多糖干预下能有效降低其浓度，显示出对骨骼肌的炎症反应有良好的干预以及对组织保护作用。白细胞介素-18（IL-18）是由巨噬细胞分泌的具有促炎作用的细胞因子，在对病原体天然免疫的防御中起重要作用，而白细胞介素-1β（IL-1β）是主要由白细胞特别是单核巨噬细胞产生的炎性因子，参与机体的炎症反应、免疫应答过程，二者促炎细胞因子成熟后被分泌到细胞外发挥其生物学作用而形成相应的炎性反应过程[21]。

本研究显示IL-1β、IL-18等炎性因子的表达水平，伴随肌细胞损伤过程，血清中的CK、LDH活性升高，提示大强度离心运动所致的EIMD造成肌细胞结构的破坏，TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子表达水平有显著性升高，显示出机体的炎症反应呈现出增高状态；其作用机制可能与大强度离心运动致骨骼肌细胞出现EIMD，而EIMD进一步促进免疫调节机制，通过对巨噬细胞产生相关效应、引起炎症反应过程加强，而草珊瑚粗多糖干预能有效降低炎症反应各相关指标，提示草珊瑚粗多糖可通过降低组织炎症反应过程对大强度离心运动产生的EIMD具有良好的修复和保护作用。

3.4 草珊瑚粗多糖对EIMD改善的效果及可能性机制

草珊瑚含丰富的多糖、黄酮类化合物以及铁、硒、锰、镁、锌、铜等物质。研究表明草珊瑚多糖具有良好的抗炎活性作用[4]，可以提高IL-1β，IL-10，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表达[1]，草珊瑚多糖其作用主要通过抑制细胞一氧化氮表达及巨噬细胞吞噬活性，调节巨噬细胞促炎和抗炎性细胞因子的表达，对免疫平衡功能进行调节。

研究中显示出大强度离心运动后大鼠骨骼肌组织出现EIMD，肌纤维结构可明显观察到肌原纤维与肌节紊乱，肌节参差不齐，肌丝排列改变、粗肌丝相互位置紊乱、部分肌丝断裂或消失，Z线出现异常包括Z带扭曲、Z线波形变化等现象。草珊瑚粗多糖的干预对于机体的炎症反应有良好的影响，其中TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子在草珊瑚多糖的作用下起到良好的抑制作用，骨骼肌组织中肌原纤维、肌节与Z线结构得到一定程度上的修复与重塑。研究显示出草珊瑚粗多糖对EIMD的干预机制可能是通过其抗炎消炎、抑制致炎因子的水平，改善机体的炎症反应，来有效改善大强度离心运动后的骨骼肌损伤，并对损伤后骨骼肌结构修复和重塑过程起到良好的作用。