RP-HPLC法同时测定金匮肾气片中黄芩苷和丹皮酚的含量

付恩桃，刘修树，李会婷，范高福，胥振国，方丽波

(1.合肥职业技术学院 生物应用技术系，安徽 合肥 238000；2.中国科学技术大学 附属第一医院，安徽 合肥 230036)

金匮肾气片是用于治疗肾虚水肿，腰膝酸软，小便不利，畏寒肢冷等症状的中成药，由地黄、酒萸肉、山药、牡丹皮、桂枝等10味中药材组成[1-2]，具有温补肾阳、化气行水的功效。金匮肾气片中的成分复杂，其质量控制难度较大，目前执行的是国家食品药品监督管理局国家药品标准(WS-10439(ZD-0439)-2002-2011Z)，标准中也缺少相关成分的定量分析。通过查阅文献资料发现，对于金匮肾气片进行质量控制的文献报道很少，且已报道的文献中仅通过测定其中一味中药材中的指标性成分的含量来控制其质量。如采用HPLC法测定金匮肾气片中丹皮酚的含量，且分析时间过长，样品前处理较为复杂，不利于金匮肾气片的质量控制[3-8]。本文采用HPLC等度洗脱法同时测定金匮肾气片片中黄芩苷、丹皮酚两种指标性成分的含量，操作简便，能够更加快速、准确、全面的控制金匮肾气片的质量。

1 仪器与试药

岛津LC-20A高效液相色谱仪，SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，MS205DU十万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)，宁波新芝SB-5200D超声波清洗器(功率300W，50kHZ)。对照品：黄芩苷(批号110715-201318，含量93.3%)、丹皮酚(批号110708-201407，含量99.9%)均于中国食品药品检定研究院购买。水为纯化水，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，金匮肾气片(特一药业集团股份有限公司，规格：每片重0.27 g)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液(52：48)为流动相，等度洗脱，检测波长278 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μl，理论塔板数按黄芩苷和丹皮酚峰计算分别为6904和16764，均不低于3000；分离度分别为7.436和2.533，均大于1.5，分离度符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

精密称取标准品(黄芩苷10.40 mg、丹皮酚10.80 mg)，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得对照品母液。精密吸取黄芩苷母液0.5 mL，丹皮酚母液1.0 mL置同一10 mL量瓶中，并用流动相稀释定容至刻度，充分振摇均匀，即得。

2.2.2 供试品溶液

图1 金匮肾气片液相色谱图A：对照品溶液 B：供试品溶液 C：阴性对照溶液 1.黄芩苷 2.丹皮酚

取金匮肾气片20片，除去薄膜衣，充分研细，精密称取细粉1 g，放置于具塞锥形瓶中，然后精密量取50%的甲醇溶液100 mL，立即称定其重量后用功率为300 W超声仪超声提取40 min，放冷至室温，再称定其重量，用50%的甲醇补足减失的重量，充分摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。取处方中除牡丹皮和地黄外的各药材，制备阴性对照溶液，阴性对照应无干扰。对照品、供试品及阴性对照色谱图见图1。

2.3 方法学试验

2.3.1 线性关系考察

精密吸取上述混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，充分摇匀，即得系列混合对照品溶液；分别取上述系列溶液20 μL，按照确定的色谱条件进样测定，将各自溶液浓度C(μg/mL)作为横坐标，黄芩苷和丹皮酚的峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，并计算得到回归方程。黄芩苷：A=95346C-4031.2(r=0.9998)；丹皮酚：A=131660C-18051(r=0.9999)，线性范围分别为：黄芩苷0.485～19.406 μg/mL，丹皮酚1.079～43.157 μg/mL。

2.3.2 精密度试验

在“2.1”色谱条件下，取混合对照品溶液进样测定，连续进样6次，计算黄芩苷和丹皮酚峰面积的相对标准偏差，分别为0.61%、1.31%，试验结果表明精密度良好。

2.3.3 重复性试验

取金匮肾气片样品(批号1181203)，在“2.2.3”方法下，平行制得6份供试品溶液，进样测定，记录黄芩苷和丹皮酚的峰面积，测得黄芩苷和丹皮酚的平均含量分别为0.427 mg/g、1.431 mg/g，RSD分别为0.30%、0.44%。

2.3.4 稳定性试验

取同一份供试品溶液，于室温下放置，并在放置0、2、4、6、8、12 h后，按上述色谱条件进样测定，计算黄芩苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为1.27%、0.55%，试验结果表明供试品溶液在配制后12 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验

取含量已知的金匮肾气片样品(批号1181203)9份，每份约0.5 g，分成低、中、高三组，分别加入黄芩苷对照品母液0.4、0.5、0.6 mL，丹皮酚对照品母液0.6、0.7、0.8 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，并计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

取金匮肾气片3批样品，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，按照外标法进行计算，得到样品中黄芩苷和丹皮酚的含量，结果如下表。

表2 金匮肾气片中黄芩苷和丹皮酚的含量(mg/片)

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取适宜浓度的黄芩苷和丹皮酚对照品溶液，分别在200～350 nm波长范围内进行紫外扫描，结果发现黄芩苷的最大吸收波长为280 nm，丹皮酚的最大吸收波长为274 nm，由于本试验是同时测定这两种成分的含量，因此选择278 nm作为测定波长，依据吸收曲线和试验结果，黄芩苷和丹皮酚在此波长下都有很好的吸收。

3.2 流动相选择

本试验在参照《中国药典》(2015版)第一部中关于黄芩和牡丹皮两味药材含量测定的基础上，先后考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙睛-水以及不同浓度的甲醇-磷酸水、乙睛-磷酸水等流动相体系，同时查阅了关于丹皮酚和黄芩苷这两种成分含量测定的相关中英文文献，绝大多数采用梯度洗脱，样品分析时间较长，通过色谱条件优化，最终选用甲醇-0.1%磷酸水溶液(52∶48)作为流动相，等度洗脱，大大的提高了样品分析的效率。加入0.1%磷酸，改善了色谱峰的峰形，且样品中待测组分与杂质完全分离。

3.3 提取时间

本实验采取超声方法提取金匮肾气片样品中的待测组分，同时比较了超声时间对提取结果的影响，结果超声20 min的样品中黄芩苷和丹皮酚的提取不够充分，超声40 min与60 min的提取效果一致，因此最终将金匮肾气片样品的提取时间确定为40 min。同时，本试验所用超声功率为300 W，通过试验发现，超声仪功率偏小也会影响提取效果。

4 结论

金匮肾气片的药品标准收载于国家食品药品监督管理局国家药品标准(WS-10439(ZD-0439)-2002-2011Z)，但标准中仅仅收载薄层色谱法控制茱萸中熊果酸的含量，且单一指标成分的测定难以全面控制药品的质量，本次试验首次建立了快速同时测定金匮肾气片中黄芩苷和丹皮酚的含量，并采用流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液等度洗脱的方法，该方法线性良好，精密度、准确度、稳定性、回收率符合要求。