不同温度对三叶虫萤卵孵化和初孵幼虫发育的影响

梅昭利，曹成全，童 超，刘方庆，徐丹阳

(乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614004)

作为一类著名的景观昆虫，萤火虫在旅游和农业等领域具有重要的应用价值，其人工繁育研究和产业应用也逐步成为行业热点(曹成全，2016，2019；陈政颐，2016；叶超，2016)。

三叶虫萤EmeiapseudosauteriFu(Ballantyne &Lambkin,2012)隶属于萤科Lampyridae峨眉萤属Emeia，是发现于四川省乐山市峨眉山的新种，在四川省广泛分布于乐山、峨眉、邛崃等地(Fuetal.,2012)。三叶虫萤的基础研究主要集中在该幼虫和成虫的形态特征、行为习性、生殖生理、栖境分析和夜间活动规律等方面(Fuetal.,2012;陈申芝等，2014；季现莹，2014；卢聪聪等，2017；陈申芝等，2018；童超等，2018；陈郑伟等，2019)。

由于成虫起飞时间早、养殖较为容易等优点(陈申芝等，2014；卢聪聪等，2017)，三叶虫萤目前成为人工繁育的优选种类。卢聪聪等(2017)研究了不同环境和介质对三叶虫萤卵孵化的影响。本文研究了不同温度对三叶虫萤卵孵化和初孵幼虫发育的影响，以期在丰富三叶虫萤生物学资料的同时，为其人工繁育和产业化提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 虫源及试验材料

1.1.1成虫选取

根据相关报道(陈申芝等，2014；童超等，2018)，成虫选取地点位于四川省乐山市绿心公园(103°42′42.00″～103°45′10.57″E,29°33′44.37″～29°35′40.11″N)内的停耕农田，采集时间为3月中旬至4月中旬。

1.1.2成虫处理

成虫室内产卵环境模拟野外产卵介质，由下到上分别为湿润土层、苔藓层、蕨类植物层，然后喷水至苔藓湿润后放入成虫，等待其交配产卵。当发现产卵，用铲子连带土和苔藓一起取其卵块，放入培养皿中分组处理。

1.1.3饲料

成虫人工饲养时可用直径约为0.5 cm的棉球蘸取5%蜂蜜水放入环境中代替野外露水，以确保其能正常生存和交配产卵。

1.1.4器材

经高压灭菌处理的培养皿，恒温培养箱(型号：郑州生元仪器有限公司MGC-250H)，卫生纸，硫酸纸，滴管等。

1.2 方法

1.2.1孵化环境

以当天采集的土和苔藓为孵化介质，加入少量湿润卫生纸巾以保湿遮阴，湿度以其野外生存环境湿度为宜(介质湿度为40%，纸巾湿度约为50%)。将取回的卵随机分配，每个培养皿中放入30粒。将湿润的卫生纸铺在卵粒上方，尽量减少对卵粒的移动和破坏。上述设置完成之后，将培养皿随机分组，每组3个培养皿，分别标号为1、2、3，将分组后的培养皿分别放置到5个恒定温度下和室内常温条件下，其中12℃、15℃、20℃、25℃、30℃通过恒温箱控制，控温误差在±1℃。在试验期间，光照为12L ∶12D，空气湿度约为90%。常温组为室内自然通风条件且减少外界条件(如天敌伤害、自然强光、恶劣天气、人为践踏、重物冲击、洪水等)对卵粒伤害以作为对照组，该组温度随自然温度变化而变化，不作特殊处理；昼夜变化范围16～28℃。

1.2.2孵化处理

每天定时检查卵粒情况，并且对其喷水保湿。每次浇水量约为每个培养皿2 mL。观察记录卵粒发霉破碎、孵化等情况。

当出现卵粒孵化时，每天定时统计不同温度下卵粒的孵化情况。待卵粒孵化完成后，统计其孵化率，以及20 d以内(20 d内三叶虫萤幼虫状态不稳定，容易死亡)的存活率。

1.2.3幼虫养殖

将同一天孵化出的幼虫放在孵化温度下进行养殖，且同一温度下同一天孵化的幼虫设为1组，并标明孵化日期和数量。将幼虫直接放置在处理过的培养皿中，培养皿中放置1张折叠为0.5 mm的湿润卫生纸，其湿度为50%。在投饵时根据其湿度情况适当浇水，以保持湿度，并且对其环境及时清理，1～3 d更换1次纸巾。

初孵幼虫用处理好后剁碎的灰巴蜗牛Bradybaenaravida肉进行喂养(陈申芝等，2014；童超等，2018)，剁碎食物以每头幼虫提供0.1 g的量盛放在大小适宜的硫酸纸上，避免食物直接放置在其环境中，污染生存环境，影响实验结果。幼虫饲养每天投饵1次，投饵时间模拟野生三叶虫萤进食时间，约为每天的17 ∶00-20 ∶00。

1.2.4数据记录

观察并记录不同温度下的孵化率和20 d内初孵化幼虫的存活率。

1.3 计算方法

1.3.1直线回归法(张孝羲，2002；郭昆等，2018)

用直线回归法推算三叶虫萤卵的发育起点温度(℃)和有效积温(K)，所有公式如下：

1.3.2直接最优法(David W，1986)

运用直接最优法计算三叶虫萤卵的发育起点温度(℃)和有效积温(K)。该方法的基本原理是利用极值法，将理论有效积温与实际测得的有效积温误差缩减到最小的目标上。理论算得的有效积温和试验测得的有效积温的误差极小为目标的目标函数，再用极值理论方法直接计算发育起点温度(℃)，涉及公式为：

式中的Di为第i组处理温度(Ti)下的发育历期，T为温度(℃)，i为处理数。

2 结果与分析

2.1 温度对三叶虫萤卵孵化的影响

室内变温条件下(通风室内环境，温度在16～28℃变化)每组卵的孵化率都高于96.00%，且个别组的孵化率为100%，平均孵化率达98.00%±1.57%，高于其他组别孵化率(P<0.001)。恒温下12～25℃三叶虫萤卵的孵化率随着温度的升高而降低；恒温12℃下的孵化率是上述温度中孵化率最高的1个，平均孵化率为94.44%±4.16%(n=3)；在恒温15℃时的平均孵化率较高为92.22%±5.67%，个别组的孵化率达到100%；恒温20℃下的平均孵化率为76.67%±7.20%，且在此温度下孵化率的最大值为83.33%，最小值为66.67%；恒温25℃下的孵化率普遍较低，平均孵化率只有44.44%±11.00%；恒温30℃时，卵孵化率最低，平均孵化率仅有13.33%±1.62%(图1)。

图1 不同温度下三叶虫萤卵的平均孵化率Fig.1 Average hatching rates of Emeia pseudosauteri eggs under different temperatures注：不同小写字母表示不同温度下孵化率差异显著。Note:Different lowercase letters indicate significant differences in hatching rates at different temperatures.

2.2 温度对三叶虫萤初孵幼虫存活率的影响

温度对三叶虫萤初孵幼虫的成活率影响显著负相关(P<0.05)。不同温度下，相同时间内孵化的幼虫存活率差别很大：在开始孵化后的20 d内，温度条件为15～30℃的初孵幼虫存活率随着温度的升高而降低；恒温12℃和30℃下初孵幼虫难以生存，存活率为0%；25℃下初孵幼虫的存活率仅为21.95%；20℃下初孵幼虫的成活率为53.62%；15℃下初孵幼虫的成活率73.17%(图2)。

图2 不同温度下三叶虫萤幼虫存活率Fig.2 Survival rates of Emeia pseudosauteri larvae under different temperatures注：不同小写字母表示不同温度下存活率差异显著。Note:Different lowercase letters indicate significant differences in survival rates at different temperatures.

2.3 温度对三叶虫萤卵发育历期的影响

温度对三叶虫萤卵的发育历期有显著的影响。随着温度的升高，卵的发育历期逐渐变短。在12℃下，卵的发育历期达到42.96±1.49 d；在15℃下，卵的发育历期达到33.47±1.87 d；在20℃下，卵的发育历期达到24.05±0.32 d；在25℃下，卵的发育历期为19.92±0.65 d；当温度在30℃时，由于温度过高，卵大部分发霉或损坏，少数能孵化，发育历期为12.75±0.25 d(P<0.001)；常温(16～28℃)条件下，卵的发育历期为20.63±1.82 d，较恒温25℃时的数值相差不大(图3)。

图3 不同温度下三叶虫萤卵的发育历期Fig.3 Developmental duration of Emeia pseudosauteri eggs under different temperatures

2.4 三叶虫萤卵的发育起点温度和有效积温

本研究根据运用直线回归法和直接最优法推算出三叶虫萤卵的发育起点温度为5.71℃和3.52℃，算出了三叶虫萤卵的有效积温分别为328.78 d·℃和382.20 d·℃。两种方法得出的发育起点温度相差2.19℃，有效积温相差了53.42 d·℃；直接最优法的变异系数c.v.(15.70%)，小于直线回归法的变异系数(25.52%)，见表1。因此，对于三叶虫萤卵的发育起点温度和有效积温，直接最优法的计算结果较直线回归法更优。

表1 三叶虫萤卵的发育起点温度和有效积温Table 1 The development zero and effective accumulated temperature of Emeia pseudosauteri eggs

3 结论与讨论

本研究结果表明，温度是影响三叶虫萤卵孵化和生长发育的关键因素：温度在室内常温(16～28℃之间变化)情况下的孵化率最高，但其20 d内的存活率较低，且室内变温条件不可控。在恒温12～30℃范围内，三叶虫萤卵均能孵化，其孵化率随温度升高而降低，发育历期也随温度升高而降低，发育速率随温度升高加快，且在高温环境下，其孵化率不稳定。温度对三叶虫萤卵的孵化率的影响与温度对小金蝠蛾卵孵化情况相似(涂永勤等，2011)，最适孵化温度也相近，为恒温15℃左右。

温度对三叶虫萤初孵幼虫的存活率影响显著。在15～25℃，初孵幼虫的成活率随着温度的升高而降低。当温度达到恒温30℃时，初孵幼虫无法长期生存，所有幼虫在24～48 h内全部死亡。初孵幼虫在恒温15℃时存活率相对较高，20 d内的存活率达到73.17%；20℃下初孵幼虫20 d内的存活率为53.62%，其它恒温温度和常温条件下的存活率都较低；恒温12℃时，由于温度太低，初孵幼虫无法长期在此温度下生存，20 d内的存活率为0%。因此，温度对三叶虫萤初孵幼虫的适温范围比较狭窄。

本研究中用直接最优法得到的三叶虫萤卵的发育起点温度为3.52℃，有效积温为382.20 d·℃，回归直线方程为T=3.52+382.20V，计算结果优于直线回归法。

综上所述，温度显著影响三叶虫萤卵孵化、存活率和发育历期。因此，人工繁育孵化时需考虑好温度等条件。建议人工孵化温度在恒温15～20℃状态下，初孵幼虫养殖尽量避免超过30℃的高温和低于12℃的低温。