基于有害结局路径的中药毒性进程动态机制研究思路

段敬怡，许妍妍，王玉明，李遇伯

（天津中医药大学中药学院，天津 301617）

随着中药国际化进程的推进，中药安全性已经越来越引起社会广泛关注。2017年，马兜铃酸致肝癌事件给中药发展带来极其恶劣的影响，亦提示当前中药毒性基础研究存在两大挑战。首先，现有毒性评价指标多难以反映不良反应发生发展的进程，毒性信息碎片化；其次，中药致毒的始动因素，即致毒成分及其直接作用靶标亦不清楚，其与机体最终的毒性效应之间的联系仍需探讨。为探讨以上难题，本文以确有肝毒性但毒性机制尚不清晰的补骨脂为例，借助有害结局路径（adverse outcome pathway，AOP）概念，应用自上而下“Top-down”策略，首先确定顶端可明确的有害结局（毒性），然后逐级阐述较低生物结构层次的关键事件（毒性进程拐点），最后，明确分子层面的相互作用，将分子起始事件（毒性始动因素）与毒性表现相联系，从而构建AOP框架。结合中药特殊性，灵活运用组学等新方法，构建中药毒性进程动态机制的研究框架。本研究不仅为补骨脂（Fructus Psoraleae）的合理用药提供指导，亦为中药毒性物质基础及作用机制提出一条可模块化研究的思路。

1 国内外研究现状及发展动态分析

1.1 基于有害结局路径的毒性研究

2017年，马兜铃酸致肝癌事件引发海内外广泛关注及激烈争论，暴露当前亟需毒性动态机制明确、始动因素清晰的毒性早期发现策略［1］。针对21世纪毒性评价现状，经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）倡导并启动AOP概念框架发展计划，即整合体外实验、体内实验和计算机模型，构建从分子起始事件到关键事件，再到有害结局等不同生物水平的反应事件及事件之间的动态联系，从而为下一步药物及化学品危险评估及毒性防控提供有力证据［2-4］。图1展示了AOP框架所包含的主要事件，包括分子起始事件即化合物与分子靶标（蛋白或DNA）的相互作用和细胞、器官、机体水平甚至种群水平发生的变化［5-6］。该框架充分考虑化合物毒性进程，对于阐释药物与毒性相关性、毒性机制及危险度评估具有重要意义。

AOP概念一经提出即引起国内外广泛关注，目前在水体复合污染和化学药物毒理学领域已有初步研究，常规可采用自下而上（Bottom-up）模式，即从一个已知的分子起始事件开始，到中间的关键事件，再到个体或种群的有害结局的研究方式［7-8］。然而中药毒性研究多呈碎片化特征，且中药作用模式很难确定分子起始事件及毒性进程的关键事件。根据中药特殊性，可灵活采用“Top-down”策略，即从机体明确的毒性效应出发，向中间低生物结构层次的关键事件研究，并将毒性效应与一个或多个分子起始事件相联系，可用于中药复杂体系的毒性机制模块化研究。随着分子生物学、组学技术、化学生物学研究的不断深入，建立以动态机制为基础的中药危险度评价将极大减少危险度的不确定因素，亦是中药安全性研究的终极目的之一［9］。

图1 有害结局路径（AOP）示意图［5-6］.“Bottom-up”模式：由已知分子起始事件向有害结局研究；“Top-down”策略：自有害结局向相联系的分子起始事件研究.

1.2 组学技术在中药毒性中的研究

经过10余年发展，代谢组学在毒理领域取得诸多突破，内源性代谢物直接参与甚至调控多条重要代谢通路，而表型代谢物的改变能高灵敏地反馈机体内毒性发生发展进程，从代谢通路动态调控角度助推毒性的早期发现、潜在机制研究及防控靶点发现［10-12］。从毒性关联的代谢生物标志物入手，分析相关代谢过程和分子信号通路，再结合其他组学信息互补更有利于中药毒性机制探索。串联质量标签技术（tandem mass tag，TMT）或相对和绝对定量的同位素标记技术（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）标记的定量蛋白质组学，具有灵敏度高、适用范围广、高通量的优势，对于揭示毒性发生发展进程及蛋白质效应靶点的筛选都具有重要意义［13-14］。代谢组学和蛋白质组学相交汇，利用代谢组学能终端反映表型组的特点及蛋白质组学靶点发现的优势，获得海量数据进行多尺度模式分析，检识毒性进程的临界阶段，鉴定具有早期预警价值的“核心靶标”，从而系统阐释中药“量-时-毒”动态关系。

1.3 中药致毒分子起始事件（直接靶标）的研究

组学动态网络的“核心靶标”可能是效应靶点，即直接靶标经级联反应产生的效应蛋白，而致毒成分的直接靶标对于进一步指导临床精准用药至关重要。近年来，化学生物学及计算化学逐渐应用于中药直接靶标的发现，可采用化学生物学中药物亲和反应靶标稳定技术（drug affinity responsive target stability）［15］、亲和色谱以及点击化学等技术，其中点击化学因其具备化学反应简单、易于模块化和立体选择性好等优势，对于中药直接靶标的发现及化合物与靶标相互作用的阐释都有重要意义［16］，已用于活性成分青蒿素［17］和姜黄素［18］靶标的研究。“钓取”的靶点可采用分子对接技术预测小分子与生物大分子结合模式，以增加直接靶标发现的准确率［19］。

1.4 中药肝毒性研究

近年来，有关中药肝毒性的文献报道日趋增多，明确报道肝毒性的中药有何首乌、大黄、柴胡、雷公藤、黄药子和补骨脂等70多种，对于中药肝毒性的认识主要集中在脂质过氧化损伤、CYP450酶代谢异常、线粒体功能失调、Ca2+浓度平衡破坏、免疫激活介导的炎症因子释放、肝肠循坏障碍和胆汁淤积等。补骨脂作为温肾助阳的常用中药，在《中国药典》收载20多种补骨脂中药制剂，多个品种已有临床不良反应报道，然而其致肝毒性研究还处于初始阶段，毒性成分主要集中在补骨脂素和异补骨脂素等几种成分，补骨脂毒性强度在一定范围内呈显著毒-量相关性和时-毒相关性，其毒性表现为胆汁淤积或肝脂肪变性［20-22］。

补骨脂化学成分复杂，然而其毒性机制及可控的毒作用靶点未见深入报道。在系统生物学和化学生物学发展迅猛的当下，对其导致肝毒性发生发展的分子机制进行必要的深入研究，发现药源性肝损伤进程的关键环节或靶点，这对于后期筛选有效的干预药物，制定合理防治措施，提高临床应用的安全性至关重要。

2 中药毒性进程动态机制的研究思路

中药安全性研究是制约中药国际化和现代化的瓶颈，针对当前中药毒性研究现状，借助AOP框架，以补骨脂为研究对象，构建其致肝毒性AOP框架，为中药毒性进程动态机制的阐明提供研究策略。研究思路的技术路线见图2。

2.1 补骨脂致肝毒性有害结局（毒性）的确证

图2 基于AOP的中药毒性进程动态机制研究思路的技术路线（以补骨脂为例）.

依据临床补骨脂大剂量中毒和小剂量长期给药致毒的特点，设置合理的给药剂量和给药时间，考察其致肝毒性特征，毒性考察指标包括肝酶活性、肝组织病理特征等。根据不同剂量补骨脂作用于动物检测指标的数据，绘制肝毒性关键检测指标与剂量和时间的“量-时-毒”变化曲线，从而明确补骨脂致肝毒性的有害结局。已有实验结果表明，补骨脂提取液可造成肝毒性，毒性程度与补骨脂的给药剂量和时间成正相关（待发表）。

2.2 补骨脂致肝毒性关键事件（毒性进程拐点）的确证

以2.1不同实验组的肝组织样本为研究对象，进行代谢组学和定量蛋白质组学分析，构建共调控网络通路，确定毒性动态进程。采用Western印迹法和定量PCR等方法验证关键蛋白在基因水平和蛋白水平的变化，通过体内和体外实验证实目标信号通路，初步发现补骨脂致肝毒性关键事件。随后再借助基因敲减、基因过表达等基因改造技术，反向验证毒性进程中关键蛋白与有害结局的信号转导机制，明确毒性进程“核心靶标”，并确定补骨脂致肝毒性关键事件。

无靶向代谢组学和TMT标记定量蛋白质组学发现显著变化的代谢物和蛋白质，代谢物包括胆汁酸类物质、谷胱甘肽和次黄嘌呤等小分子物质，相关联的蛋白质主要包括胆固醇7-α-单加氧酶、中性胆固醇酯水解酶1和丙酮酸激酶等。组学交汇分析结果显示，关键事件主要涉及胆汁淤积、能量代谢、氧化应激等方面，胆汁分泌、谷胱甘肽代谢和丙酮酸代谢等代谢途径在其中起重要作用（待发表）。

2.3 补骨脂致肝毒性分子起始事件（直接靶标）的确证

毒性进程“核心靶标”可能含有毒性发生发展的效应蛋白，还需寻找补骨脂致肝毒性的分子起始事件。基于化学生物学策略，点击化学已有不少报道用于毒性成分-靶标相互作用研究［23-25］，为直接靶标的确证提供方法学依据。首先根据文献及质谱实验确定补骨脂中主要化学成分，采用体外细胞毒性实验及肝相关生化指标等方法评估补骨脂化学成分的毒性，从而筛选补骨脂关键毒性成分。然后基于点击化学，合成炔基修饰的小分子探针用以共价结合靶标蛋白，结合后的小分子探针可与叠氮修饰的报告基团发生“点击”反应，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱解析鉴定该小分子的靶标，初步筛选毒性成分的直接靶标，每个毒性成分可能有多个直接靶标。随后采用分子对接技术，模拟毒性成分与直接靶标的结合模式，并与2.2毒性进程中的“核心靶标”进行蛋白互作分析，筛选关联性较好的直接靶标蛋白。最后将毒性成分作用于肝细胞，Western印迹法和定量PCR等方法验证直接靶标与关键事件及有害结局的关联，确证补骨脂致肝毒性分子起始事件。

2.4 补骨脂致肝毒性有害结局路径框架的构建

基于AOP构建的基本原则［2］，以及已有小分子化合物构建AOP框架的示例［26-27］。总结归纳补骨脂致肝毒性数据，层级递进，可从机体水平描述补骨脂致肝毒性的有害结局，分子、细胞和器官水平阐释肝毒性关键事件，从毒性成分与蛋白质大分子的直接相互作用的角度阐释分子起始事件。蛋白互作网络、细胞通路以及分子起始事件、关键事件的基因改造等可进一步确定有害结局、关键事件、分子起始事件之间的关系，从而构建补骨脂致肝毒性AOP框架。

通过建立基于AOP框架的中药毒性进程动态机制研究策略，为中药临床精准用药提供依据。该研究不仅仅深入阐释补骨脂的致毒机制，更为中药毒性物质基础及作用机制研究提出一条可模块化研究的方法。

3 结语

随着中药及其制剂在国内外的广泛使用，其安全问题日益突显，并成为影响中药现代化进程的关键因素之一。然而中药成分复杂，致毒的始动因素尚不清楚，碎片化毒性研究尚无法反映毒性发生发展的动态过程。本文提出了一套“Top-down”的“有害结局-关键事件-分子起始事件”的中药毒性进程动态机制研究新策略。考虑到中药的特殊性，将组学技术和化学生物学应用到中药毒性研究中，从距离毒性终端表型最近的代谢生物标志物入手，根据其涉及的代谢过程和分子信号通路，整合定量蛋白质组学，发现其调控“核心靶标”，避免毒性进程信息片面化；采用化学生物学手段，靶向发现毒性直接靶标。以毒性机制尚不清晰的补骨脂为研究对象，构建补骨脂致肝毒性AOP框架，深入阐释了其致肝毒机制，可为补骨脂的合理用药提供指导，同时为中药毒性物质基础及作用机制的研究提供新的思路。