金属酞菁-血清白蛋白杂化酶的合成及其性质的研究

赵丹丹，张恩风，莫丹，白丽娟，张玉贞，边贺东

(广西民族大学 化学化工学院 广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530006)

酞菁中心位置的空腔内有四个氮原子，容易和金属元素发生配位作用，形成具有特殊颜色的配合物，俗称金属酞菁[1]。酞菁分子中含有18π电子，因其特殊的结构，具有良好的稳定性[2]。由于金属酞菁在有机溶剂和水中的溶解性较小，研究者发现在酞菁环上引入取代基，如 —COOH、—SO3H等均能有效增强酞菁在水中的溶解度[3]。

血清白蛋白是血浆中含量最多的蛋白质，易和药物分子以分子间力相结合，常作为载体来研究[4]。通过苯酐-尿素法合成了八羧基酞菁锰(MnOCPc)和八羧基酞菁铁(FeOCPc)。在模拟人体生理条件下，使用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱等方法，研究了MnOCPc、FeOCPc与BSA 的相互作用。研究了金属酞菁及金属酞菁-BSA杂化蛋白SOD活性[5]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

均苯四甲酸酐、尿素、钼酸铵、牛血清白蛋白(BSA，分子量为66 210)、氯化铁、氯化锰、黄嘌呤氧化酶(XOD)、黄嘌呤(XO)、氯化硝基四氮唑兰(NBT)、超氧化物歧化酶(SOD)、氯化钠、乙醇、磷酸盐等均为分析纯；实验用水均为二次去离子水。

Perkkin Elmer instruments Spectrum One红外分光光度计；RF-5301 型荧光分光光度计；Jasco-810圆二色谱仪；HX-HH420A4超级恒温水浴箱；Cary100紫外-可见分光光度计；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器；arium Pro 超纯水系统。

1.2 溶液配制

配制浓度为 0.05 mol/L，pH=7.43的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，其中含有NaCl的浓度为0.1 mol/L；以PBS缓冲溶液配制牛血清白蛋白储存液(1.0×10-3mol/L)，并保存于4 ℃，用前稀释。实验中NaCl的浓度均保持在0.1 mol/L，用以维持离子强度。

1.3 金属酞菁的合成

八羧基酞菁锰(MnOCPc)和八羧基酞菁铁(FeOCPc)的制备参照文献[6]，所得产率分别为18%和20%。

1.4 金属酞菁与BSA相互作用

1.4.1 紫外-可见吸收光谱的测定 在3 mL 浓度为1×10-6mol/L的BSA溶液的石英比色皿中，用移液枪向BSA溶液中滴加金属酞菁储备液，使金属酞菁配合物浓度与BSA溶液浓度比为0～3，温度为298 K时，分别扫描纯BSA和金属酞菁配合物与BSA作用的紫外-可见光谱曲线。

1.4.2 稳态荧光光谱的测定 在3 mL 浓度为1×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色皿中，固定激发波长为280 nm，狭缝宽度均为15 nm，用移液枪每次加入3 μL 浓度为1×10-3mol/L的MnOCPc或FeOCPc储备液。使金属配合物浓度与BSA溶液浓度比为0～10，每次加完样品，搅拌均匀，静止3 min。在温度297 K，扫描300～450 nm纯BSA的荧光光谱曲线和金属酞菁与BSA作用的淬灭曲线。

1.4.3 圆二色光谱的测定 将3 mL 浓度为1×10-6mol/L的BSA溶液于石英比色皿中，用移液枪每次加入3 μL浓度为1×10-3mol/L的MnOCPc或FeOCPc储备液，使金属酞菁与BSA溶液浓度比为0～2。扫描190～280 nm范围BSA的圆二色光谱曲线和金属酞菁与BSA作用的圆二色光谱曲线。

2 结果与讨论

2.1 配合物的光谱分析

2.1.1 元素分析 MnOCPc元素分析结果为：理论值(%)：C，52.25；H，1.75；N，12.19；计算值(%)：C，52.07；H，1.79；N，12.08。

FeOCPc元素分析结果为：理论值(%)：C，52.20；H，1.75；N，12.19；计算值(%)：C，52.14；H，1.93；N，12.12。

2.1.2 紫外光谱 将MnOCPc、FeOCPc分别溶于二甲基亚砜(DMSO)，配制成1×10-6mol/L的溶液，设置波长范围为200～800 nm进行扫描，MnOCPc、FeOCPc有两个强吸收区域，在600～700 nm的Q带的吸收峰为680 nm，在300～400 nm的B带吸收峰为343 nm，与文献报道一致。证明了该产物为金属酞菁配合物[7]。

2.2 金属酞菁配合物与牛血清白蛋白相互作用

2.2.1 金属酞菁配合物与BSA相互作用的紫外-可见吸收光谱 在BSA的分子中，紫外光谱的280 nm波长处有一个由芳香族氨基酸(Trp、Tyr和Phe)造成的吸收峰。该吸收峰用于研究BSA和化合物之间的相互作用。由图1可知，在保持BSA浓度不变的情况下，逐渐滴加MnOCPc和FeOCPc溶液，BSA的紫外-可见光谱显示在203 nm和280 nm处的吸收峰逐渐降低且同时伴随着稍稍的红移[10]，说明金属酞菁与BSA进行了结合作用。图中从a到d，配合物的浓度依次为0，1，2，3×10-6mol/L，BSA的浓度为1.0×10-6mol/L。

图1 金属酞菁配合物与BSA相互作用的紫外吸收光谱

2.2.2 金属酞菁配合物与BSA相互作用的荧光光谱 BSA分子中含有能产生荧光的残基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)，当激发波长为280 nm或者335 nm时，BSA分子中色氨酸残基会产生比较强的荧光发射峰[11]。由图2可知，在298 K温度下，当激发波长为280 nm时，BSA在341 nm左右附近有比较强的荧光发射峰，在保持BSA的浓度不变的条件下，随着所加入的金属酞菁配合物浓度的增大，荧光发射峰的峰形基本保持不变，峰的强度逐渐降低，表明BSA与金属酞菁配合物之间发生了相互作用，从而引起了荧光淬灭[12]。图2的条件为：温度为298 K，λex= 280 nm，λem= 341 nm，pH=7.43，BSA的浓度为1.0×10-6mol/L，从a到k，配合物的浓度为0～2×10-5mol/L，每一浓度差为2×10-6mol/L，其底线是酞菁溶液最大浓度的荧光曲线。

图2 298 K温度下金属酞菁配合物对BSA的荧光猝灭光谱

2.2.3 金属酞菁配合物对BSA荧光淬灭机理 根据荧光猝灭过程的作用机制的不同，通常可以分为静态猝灭和动态猝灭。前者归因于荧光团和猝灭剂形成基态复合物，后者是由荧光团和猝灭剂相互碰撞引起的[13]。

荧光猝灭的过程可以利用Stern-Volmer方程来进行分析：

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

其中，F0是没有加金属酞菁配合物时BSA的荧光强度；F则是加入了金属酞菁配合物后的BSA的荧光强度；kq是猝灭速率常数；τ0是无金属酞菁配合物时BSA的平均荧光寿命(约为10-8s)；[Q]是金属酞菁配合物的浓度；KSV是Stern-Volmer猝灭常数。

根据式(1)，以[Q]为横坐标，F0/F为纵坐标作图，可以分别得到298 K温度下MnOCPc或FeOCPC与BSA作用的Stern-Volmer曲线，结果见图3和表1。

图3 金属酞菁配合物与BSA相互作用的Stern-Volmer曲线图

由表1可知，金属酞菁与蛋白质相互作用的猝灭速率常数kq均大于动态猝灭的最大猝灭速率常数2.0×1010L/(mol·s)，说明BSA与金属酞菁相互作用为静态猝灭过程。

表1 金属酞菁配合物与BSA相互作用的猝灭常数、结合常数和位点数

2.2.4 金属酞菁配合物与BSA的结合常数、结合位点数 对静态猝灭过程来说，结合位点数n和结合常数K可以通过式(2)来计算[14]：

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(2)

根据公式(2)，以lg[Q]为横坐标， lg[(F0-F)/F]为纵坐标作图(图4)。根据直线的截距和斜率可以计算出结合位点数n和结合常数K。

图4 配合物与BSA相互作用的双对数曲线图

由图4可知，金属酞菁与BSA作用的结合常数都大于104L/mol，而且计算所得结合位点数n都近似等于1(表1)，说明MnOCPc及FeOCPc与BSA相互作用的结合位点数都为1。

2.2.5 金属酞菁配合物与BSA相互作用的圆二色谱 在298 K时，BSA的浓度为1.0×10-6mol/L，从a到c，[BSA]∶[complex]=1∶0，1∶1和1∶2，见图5。

由图5可知，随着加入的MnOCPc、FeOCPc配合物浓度的增加，牛血清白蛋白的峰形保持不变，吸收峰的位置稍微向上移动，说明加入MnOCPc、FeOCPc与肽键发生了相互作用，表明配合物能够诱导蛋白质的α-螺旋含量降低，导致BSA的二级结构发生了变化。

图5 金属酞菁配合物与BSA相互作用的圆二色光谱

可以通过式(3)计算蛋白质分子中摩尔椭圆率(MRE)[15]：

MRE=θobs(m deg)/(10×n×l×Cp)

(3)

其中，θobs为椭圆度(所求MRE对应CD图上的纵坐标)，Cp为BSA的摩尔浓度(1.0×10-6mol/L)，n为氨基酸残基的数目(BSA为583)，l为样品池的厚度(1 cm)。

BSA的α-螺旋含量的定量分析可以使用以下等式获得[16]：

(4)

通过计算可以得出，纯蛋白(BSA)α-helix结构含量为63.99%，当BSA-FeOCPC、BSA-MnOCPc体系均为1∶1时，BSA的α-helix结构分别为58.8%，60.78%，说明BSA的α-helix结构含量降低，当BSA-FeOCPC、BSA-MnOCPc体系为2∶1时，BSA的α-helix结构分别为55.31%，57.61%，BSA α-helix的含量继续降低，但是仍以BSA中α-helix为主，此结果说明BSA分别与MnOCPc、FeOCPc结合引起的BSA二级结构的变化，导致了BSA中的α-helix结构百分含量减少，相对来说，FeOCPc的加入对BSA 的α-helix结构影响相对较大。

2.3 金属酞菁的SOD活性

为了进一步确定MnOCPc、FeOCPc和MnOCPc-BSA、FeOCPc-BSA的SOD活性，通过式(5)作进一步计算来获得其反应速率常数[18]：

(5)

金属酞菁配合物或金属酞菁配合物-BSA加合物的浓度为横坐标，以V0/Vcat-1为纵坐标作图，V0是NBT的还原速率，Vcat是复合物存在时NBT的还原速率，得到图6中的曲线。

图6 配合物[Complex]的V0/Vcat-1曲线图

由图6可知，MnOCPc与MnOCPc-BSA相比斜率几乎没有变化，说明加了BSA并没有明显提高其SOD活性。相对来说，FeOCPc-BSA与FeOCPc相比斜率明显的降低，说明在锰金属酞菁配合物中加入了BSA 提高了SOD活性。

为了更进一步研究FeOCPc、MnOCPc、FeOCPc-BSA、MnOCPc-BSA的SOD活性，计算了其IC50值[19]。参照式(6)可求IC50值。

ΔA0/ΔAcomplex-1=1

(6)

其中，ΔA0是添加FeOCPc、MnOCPc或其加合物之前在550 nm处吸光度的差值；ΔAcomplex是添加FeOCPc、MnOCPc或其加合物之后在550 nm处吸光度的差值；此时若以ΔA0/ΔAcomplex-1为横坐标，金属酞菁配合物或其BSA加合物的浓度为纵坐标作图，可以得到一条直线。再参考公式(7)，即可以求出IC50值，通过IC50可以进一步求出Kcat[20]。

Kcat=Kdetector[detector]/ IC50

(7)

同时测定了天然SOD酶的活性，求得其IC50值为1.56×10-6mol/L，根据式(7)，得到表观速率常数值，结果见表2。

表2 金属酞菁配合物及加合物的IC50和Kcat值

由表2可知，在没有加牛血清白蛋白之前，这两种金属酞菁配合物的SOD活性顺序为MnOCPc>FeOCPc，而加入BSA以后，SOD活性顺序为：FeOCPc-BSA>MnOCPc-BSA>MnOCPc>FeOCPc。FeOCPc的 IC50值大于相应的FeOCPc-BSA加合物的值，在加了BSA后，其表观速率常数也由原来的4.47×103M-1·s-1提高到14.95×103M-1·s-1，增加了2倍之多；说明牛血清白蛋白的加入增强了金属酞菁配合物的SOD活性。这可能归因于金属酞菁配合物与BSA结合后，BSA为其提供了疏水性空腔，BSA中某些带电荷的残基基团促进了自由基的活化，使反应更容易发生。相较而言MnOCPc加了BSA后，其IC50和Kcat几乎没有提高。说明BSA对不同金属中心的配合物促进的效果不同，原因可能与金属离子自身的性质有关，也可能与金属酞菁分子的属性有关。

3 结论

通过熔融法使均苯四甲酸酐、尿素与氯化锰反应，得到八羧基金属酞菁锰和金属酞菁铁。通过荧光光谱、紫外光谱、圆二色光谱等分析方法研究了金属酞菁配合物与BSA的相互作用。荧光光谱表明，随着金属酞菁配合物浓度的增加，BSA有规律的发生了荧光猝灭现象，说明金属酞菁锰和金属酞菁铁的加入可以使得BSA内源性荧光猝灭，主要为静态猝灭。通过Stern-Volmer方程得到了淬灭常数KSV分别为5.2×104，6.9×104L/mol，结合位点为1。紫外光谱表明，随着金属酞菁配合物浓度的增加，BSA在203，280 nm的吸光度逐渐降低，并伴有红移。圆二色光谱表明，金属酞菁配合物使BSA 的构象发生变化，α-螺旋结构含量降低。金属酞菁、金属酞菁-BSA加合物的抗氧化活性测试表明均表现出一定的SOD活性，说明牛血清白蛋白的加入增强了金属酞菁配合物的SOD活性。