七氟烷对心肌缺血再灌注内皮细胞细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1和E-选择素表达的影响

李硕鹏 王洪武 王鹤昕

（泰达国际心血管病医院麻醉科，天津 300457）

经皮冠状动脉成形术和冠状动脉旁路术是治疗心血管疾病最有效的方法，然而血管再通后的缺血再灌注损伤会使患者病情恶化，甚至引起患者死亡[1]。缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）早期血管内皮细胞的结构和功能严重损伤是构成IRI 的病理生理学基础，而血管内皮细胞是IRI时氧自由基、黏附分子和其他生物活性物质的来源。麻醉药物七氟烷具有诱导起效快和麻醉深度易调控等特点[2]，许多研究表明七氟烷对心血管抑制反应较轻，且有一定的心肌保护作用[3-5]，七氟烷预处理能够抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱导的内皮细胞中细胞间黏附分 子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表达[6]。在缺血再灌注影响下，内皮细胞表面ICAM-1、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion，molecule-1，VCAM-1）和E-选 择素表达显著升高，介导了炎症细胞的大量浸润和对心肌组织的损伤。因此，本研究拟建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探讨七氟烷对内皮细胞3 种促炎分子表达的影响，为心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和材料

SD大鼠30只，体质量250～300 g，购于北京维通利华动物技术公司（许可证号：SCXK（京）2016-001）；TUNEL染色试剂盒批号：6432344001）购于瑞士罗氏公司；CD68（批号：ab125212）、ICAM-1（批号：ab171123）、VCAM-1（批号：ab134047）和E-选择素（批号：ab18981）抗体购于美国Abcam 公司；苏木精（批号：322350）和伊红（批号：ZLI-9613）染色试剂购于北京中杉金桥公司；七氟烷购于恒瑞医药公司。

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立

大鼠心肌缺血再灌注模型的建立参考文献[7]。采用1%戊巴比妥钠麻醉后，切开大鼠气管，连接呼吸机，维持大鼠的正常呼吸和体温，并监测动脉血压。沿第5 肋间切开左胸，轻轻剥开心包，根据部位分为起始段、左心缘段和远段。缺血 30 min 后，松开夹闭的血管。实验共分为3 组，每组10 只：假手术组（对照组，不夹闭动脉）、缺血再灌注损伤组（I/R 组，缺血30 min 后，再灌注4 h）和七氟烷组（缺血27 min 时，让大鼠吸入2.5%的七氟烷，持续吸入5 min；缺血30 min 时松开血管，再灌注4 h）。通过监测仪器，记录各组大鼠手术前、缺血15 min 和再灌注4 h 的心率、平均动脉压和心率-收缩压乘积（RPP ）。在冠状动脉处每隔3～ 4 mm 取材。

1.3 检测ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素的表达

收集各组大鼠的心肌组织（体积约0.1 cm3）和冠状动脉（长约0.5 cm），10%福尔马林固定后，进行石蜡切片，一部分组织进行H-E 显色，一部分组织进行免疫组织化学显色，严格按照试剂盒说明书进行操作，简述如下：石蜡切片脱蜡，用3% H2O2室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，用PBS 浸泡5 min，采用5%山羊血清室温封闭10 min，弃去血清，滴加以1：100 比例稀释的CD68 一抗、ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素多克隆抗体4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗5 次，每次3 min，滴加以 1：1 000 稀释的二抗（生物素标记羊抗兔IgG）37℃孵育15～20 min。DAB 显示工作液在光镜下显色5 min，自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察。美国Diagnostic Instrument Inc spot-Ⅱ数码成相系统拍照；每组选取6 例，Univerval Imaging Corporation MetaMorph 图像分析系统对免疫细胞化学结果（光密度值）进行定量分析。以其光密度值变化来表示ICAM-1 和VCAM-1 蛋白表达及E-选择素的变化。其中心肌组织检测CD68+巨噬细胞数目，TUNEL染色检测凋亡细胞的比例，冠状动脉进行免疫组织化学检测内皮细胞上ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素的表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计学软件对实验数据进行处理，计量资料以±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析和Bonferroni 后续检验，2 组之间的比较采用t检验。

2 结果

2.1 血流动力学指标

手术前对照组、I/R 组和七氟烷组之间心率、平均动脉压和RPP 差异均无统计学意义（P＞0.05）；缺血15 min 时，与对照组比较，I/R 组和七氟烷组平均动脉压显著下降（P＜0.05），同时RPP 也降低明显（P＜0.05）；缺血4 h 时，七氟烷组平均动脉压和RPP 均有所上升，相对于I/R 组，差异具有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

2.2 七氟烷抑制内皮细胞ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素的表达

与对照组比较，I/R 组内皮细胞ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素的表达均显著升高（P＜0.01）。七氟烷则能够有效抑制I/R 引起的内皮细胞促炎分子的表达，与I/R 组比较，七氟烷组内皮细胞ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素的表达均显著下降（P＜0.01）（图1）。

2.3 七氟烷抑制心肌组织内巨噬细胞的浸润

对照组CD68+巨噬细胞为5.83 个/高倍视野（HPF），I/R 组数目为55.67 个/HPF，2 组间差异有统计学意义（P＜0.01）；七氟烷组CD68+巨噬细胞为18.67 个/HPF，七氟烷能够显著减少巨噬细胞的浸润，相对于I/R 组，巨噬细胞占比降低了66.46%（P＜0.01）（图2）。

表1 血流动力学指标变化情况（±s）Tab1 Changes in hemodynamic indicators（±s）

表1 血流动力学指标变化情况（±s）Tab1 Changes in hemodynamic indicators（±s）

*P＜0.05 vs control group ；#P＜0.05 vs I/R group

Group Heart rate（times）Preoperation 15 min after ischemia 4 h after reperfusion Control group 367.3±41.3 364.6±51.3 372.4±54.2 I/R group 374.9±38.4 371.5±46.9 384.3±56.2 Sevoflurane group 366.2±35.9 374.6±46.6 369.5±44.4 Group Mean arterial pressure（mmHg）RPP（mmHg/min×103）Preoperative 15 min after ischemia 4 h after reperfusion Preoperative 15 min after ischemia 4 h after reperfusion Control group 121.3±13.4 122.4±12.6 121.7±13.1 46.4±5.3 48.6±6.9 43.5±5.6 I/R group 126.6±13.1 109.2±14.1* 68.9±11.2* 47.9±5.7 39.6±8.5* 27.3±4.5*Sevoflurane group 124.6±13.5 107.4±14.9* 94.3±11.9*# 45.9±5.9 40.1±7.4* 38.6±6.2*#

图1 H-E 染色显示冠状动脉的基本形态（A）和免疫组织化学检测七氟烷抑制内皮细胞ICAM-1（B）、VCAM-1（C）和E-选择素（D）的表达，×200。箭头显示阳性表达的部位；E：各组内皮细胞ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素的表达统计图。**P＜0.01 vs 对照组；△△P＜0.01 vs I/R 组.Fig1 H-E staining showed the basic morphology of coronary artery（A）.Sevoflurane inhibited the expression of ICAM-1（B），VCAM-1（C）and E-selectin（D）in endothelial cells detected by immunohistochemisyry，×200.The arrow showed the positive expression site；E：Statistics of expression of ICAM1，VCAM1 and E-selectin in endothelial cells in each group.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs I/R group.

图2 七氟烷抑制心肌组织内巨噬细胞的浸润，×100。A1～C1：H-E 染色显示心肌组织的基本病变；A2～C2：免疫组织化学检测CD68+巨噬细胞的数目；箭头示阳性表达的部位；A：对照组；B：I/R 组；C：七氟烷组.Fig2 Sevoflurane inhibited the infiltration of macrophages in myocardial tissue，×100.A1-C1：H-E staining showed the basic pathological changes of myocardial tissue; A2-C2：Immunohistochemical detection of the number of CD68+ macrophages；The arrow showed the positive expression site；A：Control group；B：I/R group；C：Sevoflurane group.

图3 七氟烷抑制心肌细胞的凋亡，×100。TUNEL染色检测凋亡细胞的数目；箭头示阳性表达的部位；A：对照组；B：I/R 组；C：七氟烷组.Fig3 TUNEL staining was used to detect the number of apoptotic cells，×100.The arrow showed the positive expression site；A：Control group；B：I/R group；C：Sevoflurane group.

2.4 七氟烷抑制心肌细胞的凋亡

采用TUNEL 染色检测了各组心肌细胞凋亡率。结果显示对照组心肌细胞凋亡率为2.20%，I/R 组为28.63%，2 组间差异有统计学意义（P＜0.01）；七氟烷组心肌细胞凋亡率为13.81%，七氟烷能够显著降低凋亡细胞的比例，与I/R 组比较，降低了心肌细胞凋亡率的51.76%（P＜0.01，图3）。

3 讨论

饮食习惯的改变和生活水平的提高使得我国心血管疾病的发病率快速升高。通过外科手术或者介入方式再通堵塞的冠状动脉，恢复心脏正常供血是目前主要的治疗手段[8]。相对于其他实体器官的手术，心脏手术更容易受到外界因素的影响，因此对于麻醉药物的使用也更加谨慎。麻醉药物的使用方式或者浓度不当会引起患者出现心率不齐、心动过速和心动过缓等症状，严重者甚至引起患者死亡[9]。七氟烷是一种吸入麻醉药物，相对于其他麻醉剂，具有诱导迅速、安全和吸入浓度易调节等优点，因此正在心脏外科和小儿外科中迅速推广[10]。此外，许多研究表明七氟烷还能够降低心脏手术的应激反应，保护心肌细胞抵御缺血缺氧等的损伤[11-13]。本研究结果显示七氟烷能够维持心缺血再灌注损伤后平均动脉压和RPP，这说明七氟烷可作为一种有效的麻醉方式应用于心脏手术，特别是心脏移植等大型心脏手术的治疗。

冠状动脉再通后引起的缺血再灌注损伤是引起心脏损伤的一个十分重要的机制[14]。炎症细胞大量浸润心肌组织中，可攻击受损的心肌细胞，加剧心肌缺血缺氧后的进一步损伤[15]。研究表明在再灌注初期吸入七氟烷可减少中性粒细胞的聚集并保护心功能，并且七氟烷预处理可上调缺血前NF-кB、TNF-α、IL-1β 的水平，而再灌注后NF-кB、TNF-α上调的幅度降低，缩小心梗范围[16-17]，这说明七氟烷可通过改变抗炎因子的平衡而参与心肌的保护。本研究结果也显示缺血再灌注损伤条件下，七氟烷能够显著减少巨噬细胞的浸润，相对于I/R 组，巨噬细胞占比降低了66.46%，七氟烷则能够有效抑制I/R 引起的内皮细胞促炎分子的表达，与I/R 组比较，七氟烷组内皮细胞ICAM-1、VCAM-1 和E-选择素的表达均显著下降，从而可诱导单核细胞结合和浸润到心肌组织中，最终引起心肌细胞凋亡比例升高。心肌细胞是一种很难再生的终末分化细胞，损伤后心肌可发生重塑，引起患者长期出现心率失常等症状[18]。因此控制内皮细胞分子的表达对于治疗心缺血再灌注损伤具有十分重要的意义。

七氟烷还能引起活性氧增多，激活 PKC-α，后者移位到线粒体上，继而上调磷酸化凋亡蛋白 Bcl-2 的水平，抑制心肌细胞凋亡并改善能量代谢[19]。本实验TUNEL染色结果说明七氟烷能够显著降低凋亡细胞的比例，与文献报道一致。因此，在明确七氟烷对缺血再灌注损伤保护机制的基础上，在未来的研究中，应侧重于七氟烷对心肌细胞炎症和凋亡的影响，并进一步加强其作用机制的相关研究。