响应面法优化羊肚菌褐色酸奶加工工艺研究

许俊齐，谢春芹，徐虔，凡军民，张雪松

（江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院，江苏镇江212400）

酸奶营养丰富、风味独特，可改善肠胃的菌群平衡，促进人体消化吸收，降低血液胆固醇，增强机体免疫能力，且酸甜可口，风味独特，因此倍受人们青睐[1-2]。

近两年内出现了一种新型褐色酸奶产品，与普通酸奶相比，此类酸奶最大的特点在于酸奶颜色为褐色，而非自然白色[3-5]。其原理是利用牛乳中的蛋白质与还原糖在高温下发生美拉德反应而呈现褐色，美拉德反应赋予了酸奶独特的色泽、滋味及口感，因此在色泽与风味上跟传统酸奶有很大区别，又兼具独特的焦糖风味和色泽[6-10]。

羊肚菌（Morchella）属于珍稀食用菌品种，又名草笠竹，美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌、羊肚菜等。它的结构与盘菌相似，上部分呈褶皱网状，既像蜂巢，也类似羊肚的模样，因此而得名。羊肚菌除具有食用价值外，还具有很高的药用价值。性平，味甘寒且无毒，具有益肠胃助消化、化痰理气、补肾壮阳、提神补脑的功能，常被用来治疗脾虚滑泻、气虚多痰、消化不良、体虚等症状[11-12]。

本试验通过添加适量的羊肚菌汁，制备后的褐色酸奶颜色褐色适中，解决了牛乳经长时间高温褐变后高糖发酵的发酵困难、发酵风味和组织状态差等技术问题，产品焦香风味与发酵风味俱佳，组织状态均匀细腻，且发酵时间较短、品质高，结合羊肚菌特殊功效，可适合各种人群食用，提高了褐色酸奶的市场需求和羊肚菌产业综合效益。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

羊肚菌：产地为江苏省句容市，由江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院食用菌教学工场提供；葡萄糖、鲜牛奶：市售；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）：河北一然生物科技有限公司；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：丹尼斯（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

JA2003 型电子天平：上海天平仪器厂；CH2176电磁炉：杭州九阳生活电器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；LRH-150B 恒温培养箱：天津市中环实验电炉有限公司；SD-9011 色度计：上海圣科仪器设备有限公司；九阳C93T 料理机：杭州九阳生活电器有限公司；纱布、塑料杯、筷子：市售。

1.3 试验方法

1.3.1 羊肚菌褐色酸奶工艺流程

1.3.1.1 羊肚菌汁的制备

羊肚菌→挑选、清洗→打浆→均质→过滤→成品羊肚菌汁备用

1.3.1.2 羊肚菌褐色酸奶的制备

奶液+羊肚菌汁+糖进行调配→均质→褐变→冷却→接种→灌装→发酵→冷藏后熟→成品

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料的选择

选择安全卫生市售的新鲜鲜牛奶为原料，85 ℃～90 ℃下杀菌处理 20 s～30 s。

1.3.2.2 羊肚菌汁的制备

将羊肚菌用45 ℃～50 ℃的温水浸泡0.5 h。倒入体积比为 1 ∶3 水，顺时针搅拌，反复清洗 2 次～3 次，捞出沥干后，再将羊肚菌加2 倍水倒入打浆机进行打浆得菌汁，100 目筛网或双层尼龙纱布过滤后得羊肚菌汁。

1.3.2.3 混合、均质

将一定比例的羊肚菌汁和适量葡萄糖倒入预热至65 ℃～75 ℃的鲜牛奶中混合，调节均质压力10 MPa～15 MPa，均质 5 min～10 min。

1.3.2.4 褐变

均质完成后，将温度升至92 ℃～98 ℃，褐变90 min～150 min，进行褐变反应。

1.3.2.5 冷却、接种

按5%～9%发酵剂（保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1 ∶1）的添加量接种于冷却至41 ℃～42 ℃的奶液中，充分搅拌均匀，放置恒温培养箱发酵。

1.3.2.6 发酵、冷藏、后熟

将接种后的酸奶放入42 ℃恒温培养箱进行发酵培养，5 h～7 h 后终止发酵，置于4 ℃冰箱冷藏后熟，以赋予酸奶良好的口感和风味，15 h 取出即为羊肚菌褐色酸奶成品。

1.3.3 羊肚菌褐色酸奶单因素试验

本试验对影响羊肚菌褐色酸奶的3 个主要因素：羊肚菌汁添加量、发酵时间、发酵剂的添加量分别进行研究。分别设置羊肚菌汁添加量9%、12%、15%、18%、21%；发酵时间 4、5、6、7、8 h；发酵剂的添加量4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%。采用单一变量控制法进行单因素试验，考察各因素对羊肚菌褐色酸奶品质的影响，对成品进行感官评定。

1.3.4 羊肚菌褐色酸奶发酵工艺优化正交设计试验

在单因素试验的基础上，选出羊肚菌添加量（A）、发酵时间（B）、发酵剂的添加量（C）3 个因素的较佳水平，进行正交试验设计。以酸奶的感官评分为指标，选用L9（34）正交方法进行试验。正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计Table 1 Orthogonal test factors and horizontal design

1.3.5 羊肚菌褐色酸奶褐变工艺响应面设计试验

根据单因素试验结果，利用Box-Behnken 组合试验设计原理，选择褐变温度、葡萄糖添加量、褐变时间3 个因素的较佳水平，进行响应面试验设计。以感官评分为评价指标，利用Design-Expert 8.0.6 软件对试验数据进行处理，确定最佳的工艺条件。试验因素和水平见表2。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Response surface test factor level table

1.4 指标测定方法

1.4.1 羊肚菌褐色酸奶的感官评价

根据GB19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》的有关要求及标准[13]，随机选定20 人（男女各半）进行品尝。用综合评分法对产品进行感官评价，每人分别对各配方褐色酸奶进行评分，将每一组评分的平均值作为感官品尝的指标。根据色泽、口感、气味、组织状态、酸甜度、整体感觉进行评分。采用百分制评分法，具体指标评分及各项权重参考表3 所示。

表3 羊肚菌褐色酸奶感官评分标准Table 3 The sensory scoring standard of brown yogurt of Morchella

1.4.2 美拉德反应程度测定方法

美拉德反应产物呈现黄褐色，是食品香味来源之一。使用SD-9011 色度计测量不同加热条件下，褐色酸奶B 值（黄蓝值）的反应的程度。测定指标中的B值，B 值越高，其正值越大，表示黄蓝色越深，褐变反应越充分。美拉德反应越充分，即体现了褐色酸奶的浓郁焦糖风味[14]。

1.4.3 酸度的测定

按GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[15]测定酸度。

1.5 统计分析

试验数据均采用minitab 数据处理系统和WPS2016 软件进行正交数据分析及方差分析，采用Design-Expert 软件进行响应面数据分析及方差分析。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌汁添加量对酸奶品质的影响

羊肚菌汁添加量对其酸奶感官评分及酸度的影响见图1。

图1 羊肚菌汁对酸奶品质的影响Fig.1 Effect of morel juice on the quality of yogurt of Morchella

由图1 可知，当羊肚菌菌汁添加量为15%时，此时产品的感官评价最高及酸度保持在79.7°T，酸奶的酸甜适宜，伴有羊肚菌汁的清香。分析其原因可能为菌汁添加量较少时，只存在单一酸奶味道，而羊肚菌菌汁味较淡，无法产生混合后的特殊香味。反之，则亦然。因此，确定最佳菌汁添加量15%。

2.2 发酵时间对酸奶品质的影响

发酵时间对羊肚菌褐色酸奶品质的影响见图2。

图2 发酵时间对羊肚菌褐色酸奶品质的影响Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of yogurt of Morchella

酸奶的发酵时间是影响酸奶成败的关键因素，发酵时间较短，发酵不充分，产酸率较低，难以形成良好的凝乳状且酸奶风味不佳。当发酵时间超过过长时，凝乳加快，酸甜比失调，影响其感官评分。由图2 分析可知，羊肚菌褐色酸奶的感官随着发酵时间的延长呈现先上升后下降的趋势，当发酵时间为6 h 时，产品感官评分最高，为85.3 分，酸度为77.8°T，此条件下褐色酸奶组织状态较好，色泽均匀，口感爽滑，特征气味浓郁，故确定最佳发酵时间为6 h。

2.3 发酵剂的添加量对酸奶品质的影响

发酵剂的添加量对羊肚菌褐色酸奶品质的影响见图3。

图3 发酵剂的添加量对羊肚菌褐色酸奶品质的影响Fig.3 Effect of additive amount of starter on the quality of morel brown yoghurt of Morchella

由图3 可知，当发酵剂的添加量为6%时，口感滋味与酸奶的成型效果最好，感官评分达到最高为89分，酸度适中为78.8°T。当发酵剂添加量低于6%，产酸不足，酸奶无法凝固容易造成分层现象；当发酵剂添加量达到6%以上时，发酵快，风味不佳，影响酸奶的外观及口感，感官评分较低。因此确定，最佳的发酵剂添加量为6%。

2.4 羊肚菌褐色酸奶工艺优化

2.4.1 正交试验结果的极差分析

羊肚菌褐色酸奶生产工艺的正交试验表见表4。

表4 羊肚菌褐色酸奶生产工艺的正交试验Table 4 Orthogonal test of the process of morel brown yoghurt of Morchella

续表4 羊肚菌褐色酸奶生产工艺的正交试验Continue table 4 Orthogonal test of the process of morel brown yoghurt of Morchella

由表4 分析可知，各单位因素对羊肚菌褐色酸奶品质影响的主次顺序A＞C＞B＞D，即羊肚菌褐色酸奶菌汁添加量＞发酵剂的添加量＞发酵时间，羊肚菌褐色酸奶的最优配方为羊肚菌汁添加量15%，发酵时间6 h，发酵剂的添加量6%。经验证，羊肚菌褐色酸奶的感官评分达 87.9±0.3。

2.4.2 正交试验结果的方差分析

对试验结果进行方差分析，表5 数据结果显示，在本研究条件下，羊肚菌菌汁添加量影响极显著（P＜0.01），发酵剂的添加量影响其感官分值显著（0.01＜P＜0.05）。

表5 羊肚菌褐色酸奶工艺方差分析表Table 5 Analysis of variance analysis browning yogurt process of Morchella

2.5 羊肚菌褐色酸奶褐变条件响应面试验

2.5.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果及Box-Behnken 中心组合设计原理，以褐变温度（A）、褐变时间（B）、葡萄糖添加量（C）作为3 个因素，以感官评分为响应值，进行响应面优化试验。试验设计方案及数据结果如表6 所示，对表6 中数据进行方差分析，结果如表7。

表6 Box-Benhnken 设计方案及结果Table 6 Box-Benhnken design and results

采用Design Expert 8.0.6 软件对试验结果进行多元回归拟合，得出褐变温度（A）、褐变时间（B）、葡萄糖添加量（C）与感官评价和黄蓝值两个响应值之间的二次回归方程：

Y（感官评分）=+94.16-0.45×A+1.44×B+0.11×C+1.17×AB-1.42×AC-0.40×BC-3.11×A2-5.53×B2-4.58×C2

Y（黄蓝值）=+12.56+0.11×A-0.050×B+0.61×C-0.10×AB-0.18×AC-0.15×BC-2.74×A2-2.67×B2-2.09×C2

回归方程方差分析表见表7。

表7 回归方程方差分析结果可知，感官评价模型P＜0.000 1，极显著，失拟项 P 值为 0.323 0 不显著；黄蓝值模型P＜0.000 1，极显著，失拟项P 值为0.444 8，说明试验模型建立合理，试验设计可行，多项回归方程模型能准确反映褐变温度、褐变时间及葡萄糖添加量对褐色酸奶感官评价及色度值的影响。此外，感官评价模型决定系数R2=0.974 4，调整决定系数R2Adj=0.941 4；黄蓝值模型决定系数R2=0.996 6，调整决定系数R2Adj=0.992 3，说明模型拟合度较好，误差较小，可以用于羊肚菌褐色酸奶工艺条件优化试验的分析与预测。

表7 回归方程方差分析表Table 7 Regression equation analysis of variance table

续表7 回归方程方差分析表Continue table 7 Regression equation analysis of variance table

另外，从表7 回归模型系数显著性检验结果可以得出，羊肚菌褐色酸奶感官评价模型中一次项B 极显著，A、C 项不显著；二次项 A2、B2和 C2极显著；交互项AB 显著，其他交互项不显著。羊肚菌褐色酸奶黄蓝值模型中一次项C 极显著，A、B 项不显著；二次项 A2、B2和C2极显著；交互项均不显著。结果表明各影响因素对于感官评价和黄蓝值的影响非简单的线性关系。

2.5.2 因素间的交互作用

各因素之间的交互作用反应见图4 和图5。

图4 各两因素交互作用对感官评价影响的响应面图Fig.4 Response surface diagram of the interaction of two factors on sensory evaluation

响应曲面坡度越陡峭，说明响应值受到相应因素变化的影响较为显著。由图4 可知，各条件的交互作用显著，响应曲面陡峭，与方法分析结果一致。从图5可以看出，每组因素交互作用下，黄蓝值有最大值。

2.5.3 配方的优化组合及验证

图5 各两因素交互作用对黄蓝值影响的响应面图Fig.5 Response surface diagram of the interaction of two factors on the yellow-blue value

根据Box-Behnken 中心组合设计试验结果进行二次多项式回归方程计算，得到最佳配方为：褐变温度控制为94.84 ℃，褐变时间控制为123.72 min，葡萄糖添加量控制为7.03%。为了方便生产操作，将褐变温度修改为95 ℃，褐变时间为120 min，葡萄糖添加量为7%。与Design-Expert 8.0.6 得出的最优参数的评分预测值较为吻合，可见该试验设计方法可靠有效。

3 结论

通过本试验，研究了羊肚菌褐色酸奶的加工工艺，在单因素试验基础上，采用正交试验L9（34）的方法对羊肚菌褐色酸奶的加工工艺进行优化，考察了羊肚菌菌汁添加量、发酵时间及发酵剂对酸奶品质的影响。优化后得出最佳配方羊肚菌汁添加量为15%，发酵时间为6 h，发酵剂的添加量为6%，按此条件生产的褐色酸奶酸度为80.1°T，感官评分达最高值87.9±0.3，且产品组织状态良好，口感风味良好，焦糖风味突出。按照Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，分别以感官评价和黄蓝值为响应值，设计三因素三水平响应面试验设计，进行优化。方差分析发现模型显著（P＜0.05），准确度和精密度均较高，响应曲面分析研究了各因素交互作用对响应值的影响。最终通过回归方程得出了羊肚菌褐色酸奶的最佳发酵工艺条件为葡萄糖添加量为7%，褐变温度95 ℃、褐变时间120 min。在此条件下的验证试验中羊肚菌褐色酸奶的平均感官评分94.16，平均黄蓝值为12.6，与预测值基本一致。此时的羊肚菌褐色酸奶呈现褐色，焦糖风味与酸奶味结合，口感细腻顺滑，具有广阔的市场前景。