几种检测乳酸菌抑制真菌性能的方法比较

2020-05-08郝湘妹王宇航王媛杨逢源赵珊珊张华宋育超王雁萍

食品研究与开发 2020年9期

郝湘妹，王宇航，王媛，杨逢源，赵珊珊，张华，宋育超，王雁萍，*

（1.郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室，农学院，河南郑州450052；2.郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室，物理工程学院，河南郑州450052）

近年来，由于丝状真菌污染导致的食品发霉现象十分严重，在肉类、海产品、乳制品和谷物等食品保鲜中这种现象更加明显[1]。为了防止食品霉变，研究者们从各个方面寻找合适的防腐剂，通过添加防腐剂抑制未消除的或环境中的真菌生长来避免食品变质[2]。一些抗生素在体内无法代谢导致产生耐药菌株，一些真菌物种对化学防腐剂也会产生一定的抗药性。例如，许多青霉属物种通过其脱羧成反式-1，3-戊二烯而具有降解化学防腐剂山梨酸盐的能力，产生异味和“煤油样”味[3]，而且化学防腐剂的积累会对人体造成很大的伤害。因此，使用生物防腐剂被认为是减轻真菌污染的合理解决方案。生物防腐剂包括生物本身及其代谢产物，而作为生物防腐剂最合适的候选物，革兰氏阳性乳酸菌被广泛使用[4-6]。参与食物发酵的4 个主要的“核心属”被定义为乳杆菌属、小球菌属、明串珠菌属和链球菌属[7]。在食品加工过程中，可以通过添加能够抑制真菌生长的乳酸菌来达到延长食品保质期的目的。

迄今为止，关于抑制细菌的乳酸菌筛选方法报道较多。本研究以真菌作为指示菌株，参考并改良广泛应用于抑制细菌的乳酸菌筛选方法，以期建立高通量抑制真菌的乳酸菌筛选体系。目前关于乳酸菌抑制真菌的研究方法主要分为体外研究和原位研究，体外研究，如应用滤纸片法、96 孔板法、牛津杯琼脂扩散法、打孔法及双层平板划线法等[8]，前4 种方法适用于检测菌株发酵上清液的抑菌活性，最后一种方法适用于检测菌体和发酵产物的抑菌活性。原位研究，比如将乳酸菌添加到面包、酸奶或馒头中，研究乳酸菌发酵对食物保质期的影响[9-10]。采用体外研究方法测定乳酸菌抑制真菌能力时，不同方法产生的抑菌效果会有很大的差别。黑曲霉（Aspergillus niger）属于半知菌类曲霉属，是一种很常见的丝状真菌，具有丝状真菌的代表性[11]。本研究通过使用96 孔板法、牛津杯琼脂扩散法、双层平板划线法以及打孔法，研究乳酸菌对黑曲霉的抑制作用，分析并比较几种抑菌测定方法的灵敏性、简便性及可行性，为抑制真菌乳酸菌的筛选工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

乳酸菌：L.plantarum ZZUA530、L.plantarum ZZUA-537，由青贮苜蓿样品中分离得到；指示菌：从苜蓿样品中分离出来，经鉴定为Aspergillus niger。

1.1.2 培养基

MRS 固体培养基（g/L）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，乙酸钠 5.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸铵2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰 0.25 g，琼脂 17.0 g，pH（6.2±0.2），121 ℃ 20 min灭菌；MRS 液体培养基（g/L）：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，乙酸钠 5.0 g，吐温 80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸铵2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰 0.25 g，pH（6.2±0.2），121 ℃ 20 min 灭菌；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）（g/L）：马铃薯浸粉 3.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 14.0 g，pH（5.6±0.2），121 ℃ 20 min 灭菌。

1.1.3 试剂

0.9%NaCl 溶液：国药集团化学试剂有限公司；酒石酸溶液：安徽艾博生物科技有限公司。

1.1.4 仪器

D-8 紫外可见分光光度计：南京菲勒仪器有限公司；GNP-9080 隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；BD17 真空厌氧箱：上海然泰生物科技有限公司；ALLEGRA-64R 贝克曼库尔特Allegra 系列离心机：贝克曼库尔特商贸有限公司；3020 多功能微孔板读数仪：上海吉泰依科赛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌发酵上清液的制备

从-80 ℃超低温冰箱中取出乳酸菌菌株，接种至MRS 固体培养基，30 ℃厌氧培养48 h，挑取单菌落划线传代，培养48 h 后，挑取乳酸菌大致等量的一环，分别接入 1 mL MRS 液体中，30 ℃恒温培养 24 h，4 ℃条件下8 000 r/min 离心5 min，制取乳酸菌发酵上清液，备用。

1.2.2 霉菌孢子悬浮液的制备

从-80 ℃超低温冰箱中取出黑曲霉菌，接种至PDA培养基，37 ℃培养4 d 后，挑取孢子至0.9%的生理盐水中，过滤并计数[12]，直至浓度达到1.28×107CFU/mL～1.55×107CFU/mL，备用。

1.2.3 96 孔板法

根据文献[13]并加以改进，在96 孔板孔中分别取10 μL 浓度为 1.28×107CFU/mL～1.55×107CFU/mL 的霉菌孢子悬浮液加入到190 μL 的乳酸菌发酵上清液或等量的MRS 液体中，30 ℃培养24 h，测定 600 nm 处的吸光值（OD600），利用公式（1）计算抑菌率：

式中：ODLAB表示24 h 之后霉菌孢子在乳酸菌发酵上清液中的OD600；ODcontrol表示24 h 之后霉菌孢子在MRS 液体中的 OD600。

1.2.4 牛津杯琼脂扩散法

根据文献[14]进行试验，每个培养皿倾倒20 mL PDA 培养基作为下层培养基，凝固备用。将霉菌孢子悬浮液稀释至浓度为 4×105CFU/mL～4.8×105CFU/mL，以3%的接菌量接入50 ℃左右的PDA 培养基，在每个培养皿上层倾倒5 mL 含有霉菌孢子悬浮液的PDA培养基，静置，待凝固后在其上放置牛津杯，牛津杯中添加200 μL 乳酸菌发酵上清液，对照组仅添加等量的不含乳酸菌的MRS 液体，盖上陶盖，37 ℃培养24 h，观察结果。

1.2.5 打孔法

依照参考文献[15]步骤，下层倾倒20 mL MRS 固体培养基，待其凝固后，将霉菌孢子悬浮液稀释至浓度为 4×105CFU/mL～4.8×105CFU/mL，以 3%的接菌量接入50 ℃左右的PDA 培养基，在每个培养皿上层倾倒5 mL 含有霉菌孢子悬浮液的PDA 培养基，静置凝固后打孔，将乳酸菌发酵上清液添加至孔内，室温下（22 ℃）放置24 h，然后将平板置于37 ℃培养24 h，观察结果。

1.2.6 双层平板划线法

依照文献[16]，将乳酸菌菌株在MRS 固体培养基上画线，30 ℃培养24 h 和48 h。将含有霉菌孢子悬浮液的PDA 培养基倾倒在上层，待其凝固，37 ℃培养24 h，观察结果。

以上所有试验步骤均在超净工作台内进行，设置多个平行。

2 结果与分析

2.1 96孔板法

霉菌孢子在装有不同乳酸菌发酵上清液或MRS液体的96 孔板中培养24h 后结果如图1 所示。

图1 96 孔板法显示乳酸菌对黑曲霉的抑菌作用Fig.1 The antifungal effect of LAB on A.niger showed by 96-well plate method

培养24 h 后，目测霉菌孢子在菌株ZZUA530 或ZZUA537 发酵上清液中呈澄清状态，而在MRS 液体（对照）及其他菌株的发酵上清液中均有大量菌丝生长。因此，通过96 孔板法检测，菌株ZZUA530 和ZZUA537 均表现出良好的抑菌性能。霉菌孢子的OD600和乳酸菌抑菌率见表1。

表1 霉菌孢子的OD600 和乳酸菌抑菌率Table 1 OD600 of mold spores after 24 h and the inhibition rate of LAB

由表1 可知，霉菌孢子在菌株 ZZUA530 和ZZUA537 的发酵上清液中培养24 h 后溶液的吸光值没有显著差别，经计算，菌株ZZUA530 和ZZUA537 的抑菌率分别为89.94%和88.34%。

2.2 牛津杯琼脂扩散法

将经过96 孔板法筛选到的具有抑菌活性的菌株ZZUA530 和ZZUA537 的发酵上清液加入到牛津杯中培养24 h 后结果如图2 所示。

图2 牛津杯琼脂扩散法显示乳酸菌对黑曲霉的抑菌作用Fig.2 The antifungal effect of LAB on Aspergillus niger showed by oxford cup agar diffusion method

加入2 株乳酸菌发酵上清液的牛津杯底部透明，无菌丝生长，而对照组牛津杯底部有菌丝生长，呈现白色菌丝状态，使用这种方法虽然可以观察到两株乳酸菌对黑曲霉具有抑制作用，但加入两菌株发酵上清液的牛津杯周围没有出现明显的抑菌圈，所以抑菌效果不理想。这可能与霉菌孢子悬浮液的浓度太高，或乳酸菌发酵上清液的抑菌物质浓度太低有关。

2.3 打孔法

将经过96 孔板法筛选到的具有抑菌活性的菌株ZZUA530 和ZZUA537 的发酵上清液添加到底层为MRS 固体培养基、上层为含有黑曲霉孢子悬浮液的PDA 培养基孔中，经过室温（22 ℃）扩散 24 h，在 37 ℃条件下培养24 h 后抑菌效果如图3 所示。

加入乳酸菌发酵上清液的实验组和对照组相比，孔径边缘均没有透明的抑菌圈，因而利用此法无法观察到菌株ZZUA530 和ZZUA537 发酵上清液对黑曲霉的抑制作用，表明利用打孔法在测定乳酸菌抑制真菌能力方面灵敏度较低。

图3 打孔法显示乳酸菌对黑曲霉的抑菌作用Fig.3 The antifungal effect of LAB on Aspergillus niger showed by perforation method

2.4 双层平板划线法

将经过96 孔板法筛选到的具有抑菌活性的菌株ZZUA530 和ZZUA537 划线于MRS 固体培养基，分别在培养24 h 和48 h 后于其上倾倒含有霉菌孢子悬浮液的PDA 培养基，37 ℃放置24 h 后抑菌效果如图4所示。

图4 双层平板划线法显示乳酸菌对黑曲霉的抑菌作用Fig.4 The antifungal effect of LAB on A.niger showed by doublelayer plate scribe method

在乳酸菌划线周围有透明区域，因此，用此法可以观察到明显的抑菌圈。与对照组（e）相比，培养24 h（a、c）和培养 48 h（b、d）的乳酸菌对黑曲霉均显示出抑菌作用。两株菌株对比而言，菌株ZZUA530 的抑菌作用强于ZZUA537。对于同一菌株来说，培养48 h 的乳酸菌比培养24 h 的乳酸菌抑菌效果更加明显，这可能与培养时间较长乳酸菌发酵产生的抑菌物质的浓度较高有关。

3 讨论

与细菌污染相比，真菌污染更不易被控制，这与一些真菌通过孢子传播、较易扩散有关，这给防治真菌污染和抑制真菌微生物的筛选工作带来了困难。乳酸菌被认为是一种相对安全的生物添加剂，因此，建立抑制真菌的乳酸菌筛选体系，筛选高效抑制真菌乳酸菌菌株具有现实意义。本研究以黑曲霉为指示菌，对比几种抑制真菌的测定方法，为建立高通量抑制真菌乳酸菌的筛选体系提供参考。

在体外研究乳酸菌对真菌的抑制活性中，马欢欢等[13]通过使用96 孔板法研究8 株乳酸菌对黑曲霉的抑制作用，筛选出一株植物乳杆菌，本研究使用96 孔板法也观察到了不同乳酸菌对黑曲霉抑制能力的差别，此方法具有简便快捷的特点。Juodeikiene 等[16]使用牛津杯琼脂扩散法，将体系置于27 ℃培养3 d～10 d，从6 株乳酸菌中筛选出1 株能够抑制疣状青霉菌、镰刀霉菌等的戊糖片球菌。本研究使用牛津杯琼脂扩散法测定2 株经过96 孔板法筛选到的具有抑菌活性的乳酸菌发酵上清液的抑菌活性，将体系置于37 ℃培养24 h，虽然在加入乳酸菌发酵上清液的牛津杯底部未见真菌生长，但未观察到牛津杯周围出现透明的抑菌圈。这可能与培养体系不同有关，本研究体系的温度太高比较适宜真菌生长，不易被抑制，也可能与本研究使用的乳酸菌对黑曲霉的抑制能力较弱有关，因此该方法适合测定具有较强抑制真菌能力乳酸菌的抑菌性能。杨海清等[17]将从西藏灵菇中筛选出来的乳酸菌进行培养，将发酵上清液浓缩10 倍，通过打孔法研究浓缩发酵上清液对真菌的抑制作用，其抑菌圈直径均大于15 mm。本研究采用打孔法检测2 株经过96 孔板法筛选到的具有抑菌活性的乳酸菌发酵上清液对黑曲霉的抑制作用，结果未观测到抑菌圈，这可能与发酵上清液中抑菌物质浓度较低有关。Guimaraes 等[18]通过使用双层平板划线法筛选出一株能够抑制黄曲霉的植物乳杆菌，本研究使用双层平板划线法检测2株经过96 孔板法筛选到的具有抑菌活性的乳酸菌对黑曲霉菌的抑制作用，结果也出现明显的抑菌效果，而且此法能够显示使用96 孔板法测定不出的菌株间抑菌能力的差别。因此，与96 孔板法、牛津杯琼脂扩散法、打孔法对比，双层平板划线法具有更高的灵敏度，可以更直观地观察到抑菌效果，实验结果明确可靠。

在乳酸菌对真菌的抑制活性的研究中，除了体外研究，还可进行原位研究，Leyva Salas 等[19]将乳酸菌添加到乳制品中进行酸奶及奶酪发酵，发现可以延迟真菌生长2 d～24 d。本文初步研究了抑制真菌乳酸菌的筛选方法，后续工作将进一步开展乳酸菌的原位抑菌研究。