三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸

付妍，张君轩，付雪蓉，解雨晨，任泓宇，刘佳，陈修来，刘立明,3

·生物技术与方法·

三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸

付妍1,2，张君轩1,2，付雪蓉1,2，解雨晨1,2，任泓宇1,2，刘佳1，陈修来1，刘立明1,2,3

1 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122 2 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122 3 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122

L-2-氨基丁酸(L-ABA) 是一种重要的化工原材料和手性医药中间体，为了实现L-ABA的高效生产，本研究在大肠杆菌BL21 (DE3) 中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶 (Threonine deaminase，TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶 (Leucine dehydrogenase，LDH) 和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH)，构建体外级联酶催化反应实现L-苏氨酸向L-ABA的转化，体系中TD、LDH和FDH添加最适比例为1∶1∶0.2。为了简化生产工艺，将3种酶在一株菌3FT+L中共表达并实现上述配比，在30 L发酵罐中用3FT+L全细胞转化12 h，L-ABA的产量为68.5 g/L，底物L-苏氨酸的摩尔转化率达到99.0%。该工艺路线绿色高效，为未来大规模生产L-ABA提供借鉴。

L-2-氨基丁酸，三酶级联，共表达重组菌，全细胞转化，L-苏氨酸

L-2-氨基丁酸(L-ABA) 作为一种非天然氨基酸和重要的医药中间体，广泛应用于药物合成领域，如抑菌抗结核药物盐酸乙胺丁醇[1-2]、新型抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦[3]等。L-ABA合成方法包括化学法和生物法。化学法主要采用酮丁酸还原法[4]、脱硫反应法[5]、卤代氨解法[6-7]、化学拆分法[8]，但缺点是易形成消旋体，不利于手性化合物的合成，且反应条件严苛、环境污染严重、不易进行工业化生产。生物法因反应条件温和、立体选择性高和绿色环保等特点而广受关注，其中生物发酵法是对生产L-苏氨酸的大肠杆菌进行代谢改造，在含有30 g/L葡萄糖的培养基中合成5.4 g/L的L-ABA[9]。另一方法是生物酶催化法，包括腈水解酶法、转氨酶法和氨基酸脱氢酶法等。腈水解酶法是以DL-氨基丁腈为底物，直接水解L-氨基丁腈获得L-ABA，或通过腈水合酶结合L-氨基酸酰胺酶将L-氨基丁腈转化成L-ABA[10]。转氨酶法是以2-酮丁酸(2-OBA) 及提供氨基供体的L-天冬氨酸或L-谷氨酸等为底物，通过氨基转移酶或者氨基酸脱氢酶制备L-ABA，这一方法缺点是副产物草酰乙酸容易脱羧得到丙酮酸，进而生成副产物L-丙氨酸，不利于后续分离纯化[11-12]。L-氨基酸脱氢酶法是借助于中间型高温放线菌的亮氨酸脱氢酶(LDH) 将2-OBA转化为36 g/L L-ABA，产率达到88%[12]。但由于2-OBA成本高且不稳定，因此，研究人员利用苏氨酸脱氨酶(TD) 将较为廉价的L-苏氨酸转化为生产2-OBA，在此基础上通过过量表达LDH和辅酶NADH再生用酶甲酸脱氢酶(FDH)，高效制备L-ABA。如Tao等[13]在BL21 (DE3) 中分别过表达TD、LDH、FDH，转化体系中需要同时添加3种湿菌体，采用“一锅法”在30 L转化体系中将30 mol L-苏氨酸转化为29.2 mol L-ABA，产率为97.3%。

脱氢酶法具有底物成本低廉和反应不可逆等优点，但是上述研究的催化体系中通常需要添加多种酶液，并进行酶活优化配比[12-13]，增加了工艺的复杂性和生产成本，若将TD、LDH和FDH这3种酶在单一细胞中表达，可以简化生产工艺便于对反应条件进行精确调整和优化。本研究利用TD、LDH和FDH构建了体外催化L-苏氨酸生产L-ABA的级联路径，在.BL21中对3种酶共表达方式进行优化，构建了重组菌株3FT+L，实现三酶的协调稳定表达，并对转化体系进行优化，最终实现了L-ABA的高效生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

本研究使用的质粒pET28a、pETDuet、pRSFDuet均购自Novagen公司，使用的菌株见 表1。

1.1.2 实验试剂

分子生物学工具酶、SDS-PAGE Protein Marker、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等分子生物学试剂购自TaKaRa有限公司；2-OBA和L-ABA标准品购自Sigma公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp) 购自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其余常规试剂购自国药集团。

1.2 方法

1.2.1 重组菌株的构建

使用特异性引物分别从不同微生物中克隆编码TDLDH和FDH的目的基因，限制内切酶双酶切目的条带，然后连接于同样双酶切的表达载体pET28a获得重组质粒，将构建完成质粒导入BL21 (DE3) 后获得基因工程菌株。

构建共表达菌株时，从苏云金芽孢杆菌基因组中克隆编码LDH的基因，连接于高拷贝质粒pRSFDuet，构建重组质粒pRSFDuet-；将博伊丁假丝酵母来源的基因连接于pETDuet，构建重组质粒pETDuet-，从K12基因组中克隆编码TD的基因连接于质粒pETDuet-，构建重组质粒pETDuet--，将上述两种重组质粒导入BL21 (DE3)，在含有Amp和Kan的平板上筛选阳性克隆，得到双质粒共表达菌株FT+L。

FT+L菌株中重复表达基因，即在pETDuet--质粒上分别通过一步克隆试剂盒连接不同个数的基因构建质粒pETDuet- 2、pETDuet-3和pETDuet- 4。

1.2.2 培养基与培养方法

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，用于质粒的构建、扩增和种子液的培养。

宏观来讲，其中涉及到长时期演变——不同朝代的营造活动本身的时代特征；以及短时期演变——重大历史事件带来的影响，如移民活动等。中观来看不同区域的匠派发展具有其特殊的传承脉络。随着工具的进步、社会的发展及审美等的变化，本身匠派的营造发展也随之变化，结构更为稳定，同时更追求美观。具体而微，匠师个人的接受与传承活动本身就具有一定的变化与不确定性。

TB培养基：甘油4 g/L，胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，用于重组菌株发酵培养。

补料培养基：甘油500 g/L，MgSO4·7H2O 30 g/L。

种子培养条件：从斜面保藏培养基中接一环菌种至25 mL LB培养基中，根据重组菌选择压力添加100 μg/mL Kan或Amp，37 ℃、200 r/min振荡培养10 h。

摇瓶培养与诱导条件：取 1 mL的种子培养液接种于25 mL TB培养基中，根据重组菌选择压力添加100 mg/L Kan或Amp，37 ℃、200 r/min培养600至0.6时，添加100 mg/L的IPTG于25 ℃下诱导8–12 h。

发酵罐培养与诱导条件：将种子液按照5%接种量转接于发酵罐，初始发酵温度37 ℃、500 r/min下培养至600为12–14时，溶氧突然上升，此时开始流加补料培养基，通过补料控制溶氧水平在30%–40%，当600在25左右时，添加5 g/L的乳糖于25 ℃下诱导，总发酵周期24 h，发酵结束后发酵液经4 ℃离心收集菌体。

1.2.3 共表达重组菌转化条件

250 mL摇瓶转化条件优化：转速为 200 r/min，温度为30 ℃，根据不同条件添加不同酶活TD、LDH、FDH，不同浓度的L-苏氨酸，甲酸铵与苏氨酸摩尔浓度比为1∶1，NAD+30 mg/L，使用20 mmol/L磷酸盐缓冲液 (pH 7.5) 定容至 20 mL。

30 L发酵罐全细胞转化条件：搅拌转速 400 r/min，通气量15 L/min，温度37 ℃，用4 mol/L NaOH溶液控制pH 8.0，湿菌体20 g/L，L-苏氨酸80 g/L，甲酸铵与苏氨酸摩尔浓度比为1∶1，NAD+为30 mg/L，反应体积为15 L。

1.2.4 酶活测定

单酶表达重组菌株使用冻干菌体或纯酶检测酶活。共表达菌株超声破碎细胞，离心取上清液检测粗酶液酶活。TD、LDH、FDH的酶活性测定参考文献报道[14-16]。

1.2.5 检测方法

高效液相色谱法检测L-Thr、2-OBA和L-ABA浓度[13-14]。

表1 本文所用的菌株

2 结果与分析

2.1 L-苏氨酸合成L-ABA的级联反应设计与体外构建

如图1所示，L-苏氨酸转化生产L-ABA的反应分为两步：第一步是利用L-苏氨酸脱氨酶(L-threonine deaminase，TD，EC 4.3.1.19) 将L-苏氨酸脱去羟基和氨基转化为2-OBA；第二步反应利用亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase, LDH, EC1.4.1.9) 将2-OBA的羰基不对称还原为氨基生成L-ABA。由于第二步是氧化还原反应，需要辅酶NADH参与，因此在设计级联反应时需要偶联辅酶再生系统。

通过Brenda数据库(https://www.brenda- enzymes.org/)，选取来源于枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和K12的TD，因其具有较高的比酶活[17]，将3种酶基因克隆表达于BL21中，构建获得重组菌株BL21-BsTD、BL21-CgTD和BL21-EcTD。摇瓶发酵14 h收集湿菌体冷冻干燥，测定不同来源的TD对L-苏氨酸活性，BL21- BsTD、BL21-CgTD和BL21-EcTD的冻干细胞 对L-苏氨酸的比活力分别为2.04、3.21 U/mg、15.8 U/mg，因此选择来源于的TD用于第一步转化反应。采用类似的策略，将来源于、地衣芽孢杆菌、热醋穆尔氏菌、的亮氨酸脱氢酶LDH[12,18]，分别克隆表达于BL21构建重组菌株BL21-BtLDH、BL21-BsLDH、BL21-BlLDH、BL21-MtLDH、BL21-TiLDH。摇瓶发酵14 h收集湿菌体冷冻干燥，测定不同菌株的LDH对2-OBA的酶活，其中BL21-BsLDH和BL21-BlLDH对2-OBA无催化活性，BL21-BtLDH、BL21-MtLDH和BL21-TiLDH的冻干细胞对2-OBA比活力分别为1.56、0.28、1.01 U/mg，因此选择来源的LDH用于第二步转化。由于来源的FDH具有广泛的工业应用潜力[19-20]，因此在BL21(DE3)中表达来源构建重组菌BL21-CbFDH，比活力为1.38 U/mg。

图1 L-苏氨酸合成L-ABA级联反应的设计[13]

使用镍柱将TD、LDH和FDH进行蛋白质纯化(图2A)，将纯化所获得的纯酶添加到 5 mL的体外转化体系中，添加10 g/L底物L-苏氨酸，采用LC-MS结构鉴定转化液中是否催化合成了L-ABA，对转化液中产物进行检测，L-ABA分子量为103.1，使用阴离子色谱检测分子量为102.05 (图2B)，证明获得目标产物L-ABA，说明采用TD、LDH和FDH级联催化L-苏氨酸生成L-ABA是可行的。为了获得更高的转化率，对体外转化体系的3种酶的浓度及其配比进行优化。L-苏氨酸浓度为50 g/L，固定TD酶活为12 U/mL，优化TD与LDH酶活比例，结果如图2C所示，在TD与LDH酶活比为1.0︰1–2.0︰1时，L-ABA产量((40.7±0.2) g/L) 和摩尔转化率(94.0%±0.5%) 达到较高水平。固定TD与LDH酶活比为1︰1 (固定LDH酶活为12 U/mL)，体系中添加LDH与FDH酶活比为1︰0.05–1︰0.3，结果如图2D所示。当酶活比例为1︰0.2–1︰0.3时，L-ABA产量达到40.0 g/L以上，当低于该比例时，L-ABA产量和摩尔转化率均下降，说明体系中FDH酶活至少达到LDH的20%及以上，才能够保证提供充足的辅酶NADH。因此确定TD、LDH和FDH最佳比例为1︰1︰0.2，此时酶添加量最低且能够保证L-苏氨酸高效转化。

图2 体外催化TD、LDH和FDH酶活比例优化

2.2 三酶级联菌株的构建与优化

为了进一步简化工艺，将TD、LDH和FDH在BL21(DE3)中共表达，使用pRSFDuet质粒连接，质粒pETDuet将与串联表达，构建重组菌株FT+L，菌体破碎后进行蛋白电泳验证，结果如图3A所示。TD、LDH和FDH理论蛋白分子量分别为56.2、39.8、40.4 kDa，目的蛋白条带大小符合预期，由于LDH和FDH蛋白分子量相近，出现重叠条带。对重组菌FT+L的催化性能进行评价，在20 mL体系中添加L-苏氨酸10– 50 g/L，底物与湿菌体质量比为2.5︰1。当L-苏氨酸浓度从10增加至50 g/L时，摩尔转化率 从95.0%降至45.2%，而中间产物2-OBA浓度从0.43 g/L上升至25.8 g/L (图3B)。其原因是3种酶的酶活不均衡导致2-OBA无法持续转化为L-ABA，进一步测定湿细胞中3种酶的酶活，在FT+L湿细胞中，TD、LDH和FDH酶活分别为1508.8、885.0、117.1 U/g，酶活比为1.7︰1︰0.13，与体外最佳比例为1︰1︰0.2不符，FDH酶活偏低导致NADH再生效率低下，转 化通路不平衡，导致中间产物出现积累，因此对FT+L进行表达水平优化。

重复表达目标基因可以显著提高目标酶的酶活[21-22]，在FT+L中重复表达基因2–4次获得重组菌株2FT+L、3FT+L和4FT+L，蛋白电泳图谱如图4所示，表达的目的蛋白条带大小与理论值一致，菌株构建成功。检测FT+L、2FT+L、3FT+L和4FT+L湿菌体中TD、LDH和FDH酶活，结果如图5A所示。随着重复次数的增加，FDH酶活从117.1 U/g分 别上升至164.6、179.0、191.9 U/g，TD酶活从1 508.8 U/g分别下降至1 158.0、855.9、706.3 U/g，LDH酶活呈略微下降的趋势。结果显示，3FT+L中TD、LDH和FDH酶活比接近1︰1︰0.2。以3FT+L为催化剂，L-ABA产量达到42.4 g/L，摩尔转化率达到98.0%，质量转化率为84.8%，未检测到 L-Thr积累，2-OBA残留仅0.23 g/L(图5B)，表明反应体系中辅酶NADH供应正常，3种酶实现均衡协调表达。

图3 重组菌株E. coli FT+L的构建与转化效果评价

2.3 5 L发酵罐上E. coli 3FT+L生产L-ABA条件优化

为了进一步提高L-ABA的生产效率，5 L发酵罐上对转化条件进行优化。固定湿菌体质量为25 g/L，不同L-苏氨酸浓度(70–90 g/L)对L-ABA生产的影响如图6A所示。当苏氨酸浓度达到80 g/L时，L-ABA产量达到最高为62.6 g/L，摩尔转化率为90.4%，继续增加L-苏氨酸的浓度，L-ABA产量不再增加。在此基础上，固定L-苏氨酸浓度为80 g/L，不同湿菌体浓度(15–35 g/L) 对L-ABA生产的影响如图6B所示。当添加湿菌体为20 g/L时，L-ABA产量达到63.7 g/L，摩尔转化率为92.0%，继续增加湿菌体质量，L-ABA产量也不增加。

图4 fdh重复表达菌株的SDS-PAGE分析

图5 fdh基因重复表达菌株酶活检测与转化效果评价

图6 L-苏氨酸和菌体浓度对L-ABA产量及转化率的影响

考察不同温度对3FT+L全细胞级联催化性能的影响，在3FT+L湿菌体20 g/L、L-苏氨酸80 g/L时，研究不同转化温度(25–45 ℃)对L-ABA生产的影响，当转化最适温度为37 ℃，16 h时摩尔转化率达到96.5%；当转化温度低于37 ℃，转化周期延长至22 h以上；当转化温度为45 ℃时，摩尔转化率只能达到88.2% (图7A)。于是在37 ℃下考察不同pH对全细胞转化生产L-ABA的影响，在pH 7.0–8.5范围内，L-ABA摩尔转化率均能达到95.0%以上，在最适pH为8.0时转化周期最短为14 h，L-ABA摩尔转化率达到98.2% (图7B)。

2.4 30 L发酵罐规模化生产L-ABA

在30 L发酵罐上采用分批补料的方式培养3FT+L，随着菌体浓度不断增加，酶活不断提高，发酵24 h湿菌体浓度达到105.9 g/L，此时发酵液中TD、LDH和FDH的酶活分别达到114.7、101.0、22.3 U/mL (图8A)，TD、LDH和FDH酶活比为1︰1︰0.2。

30 L发酵罐中转化体积为15 L，3FT+L湿菌体20 g/L，L-苏氨酸80 g/L，温度37 ℃，使用NaOH调节pH为8.0，随着转化时间的增加，L-ABA逐渐积累，当12 h时L-ABA产量最高达到68.5 g/L，摩尔转化率达到99.0%，质量转化率达到85.6%，L-ABA生产速率为5.71 g/(L·h) (图8B)。

图7 温度和pH对转化反应的影响

图8 E. coli 3FT+L高密度发酵与转化生产L-ABA

3 结论

利用TD、LDH和FDH三酶级联转化L-苏氨酸生产L-ABA，目前存在辅因子NADH再生用酶的效率较低、多酶催化的转化速率协同性差、需要培养多种基因工程菌使成本高等问题。针对上述问题，本研究开发了一种高效简约制备L-ABA工艺路线，采用一次性投料，转化体系中添加单一细胞3FT+L 20 g/L，转化12 h，L-ABA产量达到68.5 g/L，摩尔转化率达99.0%，为后续酶法规模化生产L-ABA奠定一定的理论基础。

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Production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine using a trienzyme cascade

Yan Fu1,2, Junxuan Zhang1,2, Xuerong Fu1,2, Yuchen Xie1,2, Hongyu Ren1,2, Jia Liu1, Xiulai Chen1, and Liming Liu1,2,3

1State Key Laboratory of Food Science & Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

L-2-aminobutyric acid (L-ABA) is an important chemical raw material and chiral pharmaceutical intermediate. The aim of this study was to develop an efficient method for L-ABA production from L-threonine using a trienzyme cascade route with Threonine deaminase (TD) from, Leucine dehydrogenase (LDH) fromand Formate dehydrogenase (FDH) from. In order to simplify the production process, the activity ratio of TD, LDH and FDH was 1:1:0.2 after combining different activity ratios in the system. The above ratio was achieved in the recombinant strain3FT+L. Moreover, the transformation conditions were optimized. Finally, we achieved L-ABA production of 68.5 g/L with a conversion rate of 99.0% for 12 h in a 30-L bioreactor by whole-cell catalyst. The environmentally safe and efficient process route represents a promising strategy for large-scale L-ABA production in the future.

L-2-aminobutyric acid,trienzyme cascade, co-expressed recombinant bacteria, whole-cell catalyst, L-threonine

June 14, 2019;

June 24, 2019

Supported by:The Key Technologies R & D Program of Jiangsu Province (No. BE2018623), The Key Field R & D Program of Guangdong Province (No. 2019B020218001), The National First-class Discipline Program of Light Industry Technology and Engineering (No. LITE2018-08).

江苏省科技支撑计划社会发展项目(No. BE2018623)，广东省重点领域研发计划(No. 2019B020218001)，国家轻工技术与工程一流学科自主课题 (No. LITE2018-08) 资助。

Liming Liu. Tel/Fax: +86-510-85197875; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.190256

付妍, 张君轩, 付雪蓉, 等. 三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸. 生物工程学报, 2020, 36(4): 782–791.

Fu Y, Zhang JX, Fu XR, et al. Production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine using a trienzyme cascade. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 782–791.

(本文责编 郝丽芳)