中药药渣中的微生物固氮、解磷能力测定方法的改进

王明欢，刘莹，张英

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

固氮菌固氮能力的测定通常采用凯氏定氮法[1]，但凯氏定氮法存在耗时长，操作麻烦，所用试剂具有腐蚀性、精度差、最低检测限高、微量氮难以检测出来等弊端。此外，也可采用乙炔还原法[2]测定固氮能力，该方法简单、快速、灵敏度高，但测定结果的可靠性不强，准确性差，需要用其他方法校正。本研究采用HJ 636—2012《水质总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》测定固氮菌发酵液中的氮含量，不仅灵敏度高，而且仪器设备简单，操作简便快速，应用广泛。该方法规定空白试验的吸光度不超过0.03[3]，但在实际测定时，由于购买的普通过硫酸钾试剂纯度不够，经常会出现空白样品校正吸光度值达不到标准的情况。

解磷菌解磷能力的测定方法一般有固体平板法、土壤培养法和液体培养法。固体平板法只能定性不能定量；土壤培养法是将微生物在土壤中培养一段时间后用钼锑抗分光光度法测定土壤中有效磷含量；液体培养法中较常用的测定方法是钼锑抗分光光度法[4]。本研究的药渣解磷菌为液体培养，因此选用钼锑抗分光光度法测定解磷能力。在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸盐、酒石酸锑钾反应生成磷钼杂多酸，被抗坏血酸还原后，生成的蓝色络合物磷钼蓝在700 nm处有最大吸收峰[5]，但在显色过程中，经常会出现蓝色沉淀和吸光度值过低的情况，可能因为显色时酸度不够，磷钼杂多酸和过量钼酸铵同时被还原，影响显色体系稳定性，或者因为酸度过高，破坏磷钼蓝的结构，导致显色不完全，测定结果偏低[6]。

本课题组之前已从中药药渣中分离出高效的固氮菌和解磷菌，但在测定其固氮、解磷能力时，发现存在上述问题，本研究分别对试剂及检测过程进行改进，以求能够精确地测定出固氮菌和解磷菌的固氮能力及解磷能力。

1 仪器与材料

1.1 仪器

WFZ UV-2100紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；YXQ-SG46-280SA手提式压力蒸气灭菌器(上海博迅实业有限公司)；VD-650桌上式洁净工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2 菌种

实验室从中药药渣(广州中医药大学制药工程实验室外已堆放1 a的夏桑菊药渣和广州某中药厂生产的未知药渣)中分离出的固氮菌GD-5和解磷菌JP-1。

1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g(液体培养基不加)，蒸馏水1 L。

Ashby培养基：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO35.0 g，K2SO40.2 g，琼脂20 g(液体培养基则不加)，蒸馏水 1 L。

无机磷培养基：葡萄糖10 g，Ca3(PO4)225 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO40.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，琼脂20 g(液体培养基则不加)，蒸馏水1 L。

1.4 主要试剂

琼脂粉(广东环凯微生物科技有限公司)；钾长石粉(广州翔博生物科技有限公司)；抗坏血酸、酒石酸锑氢钾、钼酸铵(上海麦克林生化科技有限公司)；K2S2O8(天津致远化学试剂有限公司)；葡萄糖、NaOH、KNO3、H2SO4、KH2PO4、K2SO4、NaCl、CaCO3、MgSO4·7H2O、NaH2PO4、(NH4)2SO4、KCl、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Ca3(PO4)2、无水乙醇均为分析纯。

1.5 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法试剂

①碱性K2S2O8溶液：称取40 g K2S2O8溶于600 mL无氨水中(可置于50 ℃水浴中加热至全部溶解)；另称取15 g NaOH溶于300 mL无氨水中。待NaOH溶液温度冷却至室温后，混合2种溶液定容至1 000 mL。可保存1周。

②KNO3标准储备液(ρ=100 mg/L)：称取0.721 8 g KNO3溶于适量水，移至1 000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。

③KNO3标准使用液(ρ=10.0 mg/L)：量取10.00 mL KNO3标准储备液至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，现配现用。

1.6 钼锑抗分光光度法试剂

①10%抗坏血酸溶液：溶解10 g抗坏血酸于水中，并稀释至100 mL。该溶液储存在棕色玻璃瓶中，在4 ℃可稳定几周，如颜色变黄，则弃去重配。

②钼酸盐溶液：溶解13 g钼酸铵于100 mL水中。溶解0.35 g酒石酸锑氢钾于100 mL水中，在不断搅拌下，将钼酸铵溶液徐徐加入300 mL(1+1)硫酸中，加酒石酸锑氢钾溶液混匀，储存在棕色的玻璃瓶中4 ℃保存。

③磷酸盐储备溶液(ρ=50 mg/L)：称取0.219 7 g于110 ℃干燥2 h的KH2PO4溶于水中，移入1 000 mL容量瓶中，加入5 mL(1+1)硫酸，用水稀释定容至刻度。

④磷酸盐标准使用液(ρ=2 mg/L)：量取10.00 mL磷酸盐储备液于250 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，现配现用。

2 方法与结果

2.1 固氮菌与解磷菌的分离

取10 g药渣加入20 mL无菌水震荡5 min，并逐级稀释至10-1、10-2,3个浓度各取0.2 mL分别涂布于Ashby培养基和无机磷培养基上,28 ℃培养48 h，挑取能够生长的单一菌落，用平板划线法进一步分离纯化，挑取单菌株，转接至斜面保藏培养基[7]。

2.2 固氮能力测定方法的完善

2.2.1 固氮试验 从斜面挑取一环GD-5菌落，接入平板上活化，于30 ℃培养2 d，挑取数环接入液体培养基中扩大培养，2 d后接种一定量的液态种子至Ashby培养基，平行3瓶，同时以不接菌的培养基作为对照。30 ℃发酵培养7 d。

2.2.2 固氮能力的测定 采用《水质总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》(HJ 636—2012)[3]。

2.2.3 K2S2O8重结晶次数的确定 将装有1 000 mL无氨水的烧杯置于50 ℃水浴锅加热，然后逐渐加入K2S2O8直至不能溶解为止，然后把完全溶解的饱和溶液放进室温中自然冷却，再放进4 ℃冰箱重结晶，过夜后，倒掉上清液，然后用冰好的无氨水清洗几遍，将晶体放入50 ℃烘箱烘干。如此重复4次，每重结晶1次测定1次空白样品吸光度值。不同的重结晶次数对空白吸光度值的影响结果见表1。可见，随着重结晶次数的增加，校正吸光度逐渐减小，并最终达到要求。

表1 不同重结晶次数下所测得空白样品的吸光度

重结晶次数A220 nmA275 nmA220 nm-2A275 nm00.479±0.0010.010±00.459±0.00110.424±0.5770.012±0.5770.400±0.00120.067±0.0030.003±0.0010.061±0.00330.125±0.0020.044±0.0020.037±0.00740.018±0.577-0.002±00.018±0.577

2.2.4 标准曲线的制备 分别量取0、1、3、5、7 mL KNO3标准使用液置25 mL容量瓶中，加无氨水稀释至10 mL，再加入碱性K2S2O8溶液5 mL，盖好盖子，用牛皮纸包紧瓶口，在121～124 ℃消解45 min[8]，冷却后，分别加入1 mL(1+9)HCl溶液，用无氨水定容至刻度，待测。结果显示，在0～70 μg质量范围内，吸光度值与氮的质量呈良好的线性关系，线性方程为Y=0.010 4X-0.002 3，R2=0.999 7。

2.2.5 固氮菌GD-5固氮能力的测定 将发酵7 d的固氮菌GD-5发酵液于10 000 r/min离心15 min后，量取1 mL上清液置于25 mL容量瓶中，用无氨水稀释至10 mL，加入5 mL碱性K2S2O8(经重结晶得到)溶液，塞紧瓶塞，用牛皮纸包好后于121～124 ℃消解45 min，冷却后，加入1 mL(1+9)HCl溶液，用无氨水定容至标线，待测。以10 mL无氨水代替样品溶液作为空白对照。GD-5固氮能力见表2。可见，在液态发酵培养基中，该菌固定空气中的氮后发酵液中氮浓度达到13 mg/L左右。

表2 固氮菌GD-5固氮能力测定结果

组别A220 nmA275 nmA220 nm-2A275 nmρ(氮)/(mg·L-1)空白0.083±0.0060.001±0.0020.081±0.007GD-50.230±0.0100.007±0.0030.216±0.01613.202±2.046

注：空白组氮浓度未测。

2.3 解磷能力测定方法的完善

2.3.1 解磷试验 从斜面挑取一环JP-1菌落，接入平板上活化，于30 ℃培养2 d，再挑取数环接入液体培养基中扩大培养，2 d后取一定量的液态种子接入无机磷培养基，平行3份，同时以不接菌的培养基作为对照，于30 ℃发酵培养7 d。

2.3.2 解磷能力的测定 解磷能力的测定采用钼锑抗分光光度法[5]。

2.3.3 标准曲线的制备 分别量取0、5、10、20、25 mL KH2PO4储备液置50 mL容量瓶中，定容，加入10%抗坏血酸1 mL，30 s后加钼酸盐溶液2 mL，15 min后于700 nm处测定吸光度值。结果显示，在0～50 μg质量范围内，吸光度值与磷的质量线性关系良好，线性方程为Y=0.010 8X-0.002 7，R2=0.9999。

2.3.4 不同酸度对解磷菌JP-1解磷能力的影响 将发酵7 d的解磷菌JP-1发酵液于10 000 r/min离心15 min后，量取0.5 mL上清液置50 mL容量瓶中，加入不同体积的(1+1)H2SO4溶液调节pH，用蒸馏水定容至刻度，加10%抗坏血酸1 mL，30 s后加2 mL钼酸盐溶液显色，15 min后以蒸馏水为对照，于700 nm处测定吸光度。

调整样品至不同的pH值，结果见表3。可见，pH>4.4时，显色体系不稳定，出现沉淀，吸光度达到紫外分光光度计测定上限；pH<4.4时，吸光度值偏低；pH=4.4时，吸光度值最大，且处于标准曲线区间内，结果最为准确。

表3 解磷菌JP-1解磷能力测定结果

酸度组别A2700nm可溶性磷/(mg·L-1) 不加H2SO4空白3.010±0JP-13.010±00±0加1 μL(1+1)H2SO4空白3.010±0JP-13.010±00±0调节pH至4.4空白0.283±0.020JP-10.572±0.16254.389±26.296加1 mL(1+1)H2SO4空白0.002±0JP-10.037±0.0016.981±0.004

注：空白组作为对照，可溶性磷浓度未测。

3 讨论

采用碱性K2S2O8消解紫外分光光度法来测定固氮菌发酵液中的氮含量时，购买的K2S2O8试剂纯度不够，空白校正吸光度难以达到标准中的要求(吸光度<0.03)，而进口K2S2O8价格昂贵，为此，实验室尝试将K2S2O8重结晶4次后，可解决这一问题。

钼锑抗分光光度法的原理是在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸盐、酒石酸锑钾反应生成磷钼杂多酸，被抗坏血酸还原后，生成的蓝色络合物磷钼蓝在700 nm处有最大吸收峰。测定解磷菌解磷能力的关键在于酸度的控制，酸度太低，显色时会产生沉淀，从而使吸光度值达到紫外分光光度计的上限，测定结果没有意义；酸度太高，显色不完全，吸光度值偏低，导致计算出的有效磷含量偏低，影响实验结果。本研究通过改变样品的pH值，调节pH值到4.4时，可以达到很好的显色效果。

通过上述改进，可以更加精密准确的测定出固氮菌的固氮能力、解磷菌的解磷能力，为后续从中药药渣中大量筛选两类功能菌及菌剂组合打下基础。