硫氰酸红霉素原位杀藻的生态学效应

王雪莹，毕相东*, 董少杰，尤宏争，刘克明，戴伟, 李宛津

(1.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384；2.天津市水产研究所，天津 300221)

长期以来，以铜绿微囊藻Microcystisaeruginosa为主体的蓝藻水华给淡水养殖造成了巨大危害，已成为限制淡水养殖业健康发展的主要瓶颈之一[1-2]，尤其是对缺水较为严重的北方地区淡水养殖业危害更大[3]。自然状态下，微囊藻包括产毒微囊藻和非产毒微囊藻两种生态型，产毒微囊藻可产生一类化学性质稳定的原发性肝癌毒素——微囊藻毒素(Microcystins，简称MCs)[4]，化学结构见图1，其中以MC-LR和MC-RR两种异构体最为常见且毒性较大[5]。产毒微囊藻正常生长过程中MCs主要储积于藻细胞内[6]，藻细胞死亡后胞内毒素就会释放至水体中[7]。蓝藻水华暴发盛期，水体中MCs含量最高可达到10 μg/L[8]。MCs对水生动物有较强的毒害作用，可以显著抑制其胚胎发育、生长及繁殖，严重时甚至导致其大规模死亡[9-10]，同时储积在养殖动物体内的MCs又威胁着水产品质量安全[11]，造成淡水养殖经济效益严重受损，故实际养殖生产中多会使用杀藻剂应急抑杀蓝藻。

以往养殖生产中，采用硫酸铜或螯合铜应急抑杀水华蓝藻效果虽佳，但极易造成养殖水域重金属离子的二次污染，由此不仅对养殖动物生存造成严重胁迫，还威胁着水产品质量安全[12]。

硫氰酸红霉素(Erythromycin thiocyanate)对细菌等原核生物具有很好的抑杀效应，在水产养殖业中已广泛使用[13-14]，其化学结构见图1。已有研究表明，当硫氰酸红霉素含量大于10 μg/L时，水体中微囊藻细胞受到明显损伤[15-16]。因此，若在养殖生产中采用硫氰酸红霉素应急抑杀蓝藻可能会造成蓝藻大量死亡，而短时间内大量释放出来的MCs严重威胁着养殖鱼类的存活。底泥界面是MCs主要归趋场所[17]，在受到搅动及水化学指标变化时[18]，沉积于底泥中MCs又会被释放至上覆水中[19]，因此，明确底泥表层MCs含量将对评估养殖水体中MCs含量及其危害具有重要意义。

本研究中，拟以硫氰酸红霉素作为应急杀藻剂，开展硫氰酸红霉素原位杀藻的生态学效应研究，分析硫氰酸红霉素作用下生态围隔内的蓝藻丰度、底泥MCs含量及关键水化学指标的动态变化规律，以期摸索出兼顾杀藻效果与MCs释放量的最优杀藻技术流程，这将对科学使用杀藻剂及避免由杀蓝藻所诱发的MCs对养殖动物的危害具有非常重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选址在常年频繁暴发蓝藻的淡水鱼类养殖尾水循环渠中，以高密度不透水帆布为分隔材料、以不锈钢铁架和钢管为支架，搭建底面直径1.2 m、高2 m的圆柱体生态围隔，生态围隔上面高出水面20～30 cm，下部伸入到底泥，试验共建立15个生态围隔(图2)。

硫氰酸红霉素(分析纯)购自天津鼎正药业公司，MC-RR、MC-LR标准品为白色粉末，纯度为95%；三氟乙酸(分析纯)购自济南化工科技公司。

1.2 方法

1.2.3 微囊藻毒素的测定

(1)微囊藻毒素标准曲线的制备。标准品MC-RR、MC-LR母液的制备参照国标法(GB/T 20466—2006)[22]，取适量母液加超纯水稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。使用安捷伦 1260 Infinity II 高效液相色谱仪测定峰面积及确定每种毒素的出峰时间。测定条件为：进样量20 μL，色谱柱温为40 ℃，紫外可见光检测器波长为238 nm，流动相为0.05%三氟乙酸和60%甲醇(色谱纯)。

(2)底泥样品采集及微囊藻毒素的萃取。底泥中MCs测定方法参照樊洁等[23]的方法。使用彼得逊采泥器取表层底泥沉积物，冷冻后带回实验室。于-80 ℃下反复冻融5次后混匀、真空冻干，用90%的甲醇反复萃取3次，取上清液减压蒸发浓缩，采用预先活化的C18小柱进行毒素的富集，用20%甲醇溶液淋洗，再用含0.1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，洗脱液在40 ℃减压浓缩至近干，用甲醇溶液定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜后进行HPLC检测，检测条件同(1)。

(3)微囊藻毒素回收率的测定。回收率是评价MCs萃取过程中的一个重要指标，测定方法采用加标-回收法，具体为在适量底泥样品中加入0.1 mL毒素标准品(MC-RR和MC-LR)充分混匀，随后按照(2)中的方法测定微囊藻毒素浓度。回收率计算公式如下：

底泥回收率=(加标底泥样品测定值-底泥样品测定值)/加标量×100%。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0对试验数据进行单因素方差分析，用LSD法进行组间多重比较。

2 结果与分析

2.1 硫氰酸红霉素作用下生态围隔中蓝藻及微囊藻丰度与生物量的动态变化规律

试验期间围隔中出现10个属(种)的蓝藻，分别为微囊藻Microcystis、细小平裂藻Merismopediaminima、色球藻Chroococcusminutus、颤藻Oscillatoriasp.、优美平裂藻Merismopediaelegans、席藻Phormidiumsp.、尖头藻Raphidiopsissp.、隐球藻Aphanocapsasp.、螺旋藻Spirulinasp.。

从图3可见：硫氰酸红霉素对蓝藻有较强的杀灭作用，且呈现出明显的浓度效应，试验结束时，所有硫氰酸红霉素处理组对蓝藻杀灭率均达99%以上；微囊藻的丰度和生物量与蓝藻的变化趋势相似，到试验结束时，硫氰酸红霉素作用下微囊藻丰度为(0～1.32)×106cells/L，生物量为0～0.66 mg/L。整体上来看，在满足杀藻效果基础上，浓度为0.25、0.5 mg/L的硫氰酸红霉素杀藻性能相对缓和些。

2.2 硫氰酸红霉素作用下底泥中MCs含量的动态变化规律

微囊藻毒素标准品MC-RR与MC-LR浓度与对应峰面积的线性回归方程分别为y=23.872x-7.6868(R2=0.999)和y=26.741x+2.9529(相关系数R2=0.999)，均显示出良好的线性关系，且有较宽的微囊藻毒素浓度检测范围。进一步检测表明，本研究中底泥MC-RR和MC-LR的萃取回收率分别为16.8%和30.1%。

从图4可见：在硫氰酸红霉素作用下，底泥中MC-RR和MC-LR含量均呈现短时间内(2 d)有明显升高趋势，其中MC-LR含量增高趋势较MC-RR明显，MC-RR和MC-LR含量最高时分别达(2.58±0.99)、(3.39±0.23)μg/g；随后多数硫氰酸红霉素处理组MC-RR和MC-LR含量呈现明显下降趋势，直至试验结束时，MCs仍高于对照组；结合蓝藻及微囊藻丰度动态变化规律可知，在硫氰酸红霉素作用下短时间内藻细胞大量破裂死亡，释放出来的藻毒素大量储积在底泥表层沉积物中。依据硫氰酸红霉素作用下底泥表层沉积物中MCs含量变化规律，建议采用≤0.25 mg/L硫氰酸红霉素应急杀灭蓝藻，以降低藻毒素对养殖动物的毒害效应。

2.3 硫氰酸红霉素作用下养殖水体中关键水化学指标的动态变化规律

3 讨论

3.1 硫氰酸红霉素对蓝藻的抑杀作用

硫氰酸红霉素属大环内酯类抗生素，是红霉素的硫氰酸盐，既降低了红霉素的毒副作用，又保留了红霉素对原核生物的杀灭活性，是中国农业农村部允许使用的水产药剂，在水产养殖中已得到广泛应用[24]。已有试验表明，硫氰酸红霉素可有效抑制微囊藻可溶性蛋白的合成，从而达到杀藻效果，96 h EC50为48.2 μg/L[15]。本试验中各浓度硫氰酸红霉素对蓝藻及微囊藻都有很好的杀灭效果，且呈现出明显的剂量依赖效应，试验结束时对蓝藻及微囊藻杀灭率均达99%以上。可见硫氰酸红霉素在应急防控养殖水域蓝藻水华方面具有明显的优势。

3.2 硫氰酸红霉素对底泥中微囊藻毒素含量的影响

底泥是MCs在养殖水体中储积的主要场所，生物降解是MCs环境归趋的主要途径，底泥中细菌对MCs生物降解起着至关重要的作用[8]。田大军等[25]研究指出，正常蓝藻暴发时，底泥中MC-RR含量最高可达到0.802 μg/g，樊洁等[23]研究表明，自然水体下底泥中MC-LR含量最大值为0.28 μg/g，MC-RR最大含量为0.32 μg/g。本试验表明，暴发蓝藻水壶的生态围隔中加入硫氰酸红霉素后底泥中MC-RR含量最高达2.58 μg/g，MC-LR最高为3.39 μg/g，其藻毒素含量明显高于自然水体中底泥的含量，究其原因可能是在硫氰酸红霉素作用下蓝藻细胞破裂死亡，短时间内释放出大量MCs储积在生态围隔底泥中，远远超过底泥环境中MCs降解微生物的降解负荷。当硫氰酸红霉素浓度为0.25 mg/L时，短时间内储积在底泥中MCs总量较小，且杀藻效果完全满足实际生产需要，可以考虑在实际养殖生产中应用该浓度硫氰酸红霉素应急防控蓝藻水华，但仍需提前使用VC等高效解毒剂，以降低杀藻给养殖动物带来的次生伤害。

3.3 硫氰酸红霉素应急杀藻对水化学指标的影响

4 结论