胡敏酸对土壤中DnBP降解动力学及微生物活性的影响

2020-05-05李玉双刘厶瑶宋雪英侯永侠魏建兵赵晓旭

沈阳大学学报(自然科学版) 2020年2期

李玉双, 刘厶瑶, 宋雪英, 侯永侠, 徐硕, 魏建兵, 赵晓旭

(1. 沈阳大学环境学院, 辽宁沈阳 110044; 2. 莆田学院环境与生物工程学院, 福建莆田 351100)

邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters, PAEs)是一类邻苯二甲酸与醇类生成的酯的统称,作为重要的增塑剂和软化剂,被广泛应用于各行业.PAEs具有较强的内分泌干扰和生殖毒性效应,部分PAEs还具有致癌、致畸、致突变作用,对生态环境和人体健康构成了极大的危害[1-2].土壤的 PAEs污染主要源于大气沉降、污水灌溉、垃圾堆放、塑料薄膜使用等直接或间接途径,使土壤成为 PAEs污染物的汇[3-5].周生贤指出, 我国受污染的耕地约占全国总耕地面积的8.3%[6].调查数据[7-9]显示,我国多地工农业区土壤已被PAEs不同程度污染,污灌区和蔬菜基地土壤污染相对较为严重,其中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-lzethyl hexyl phthaiate,DEHP)和邻苯二甲酸正二丁酯(di-n-butyl phthaiate, DnBP)2种组分的检出率和污染程度较高.

腐殖质(humicsubstances)是动、植物及微生物残体在生物与非生物降解、聚合等作用下形成的天然有机质[10].腐殖质是区域生态系统中最丰富的有机质形式,对元素的生物地球化学循环等生态功能均具有重要影响[11].胡敏酸(humic acid, HA)中含有羧基、酚羟基、醇羟基、醌型羟基、酮型羟基等官能团,具有很强的反应活性,并能够吸附Cu2+,Pb2+,Cd2+,Zn2+,Ni2+等重金属离子和持续有机污染物[12].Sannino 等[13]在修复意大利北部老工业区时,向土壤中添加外源性胡敏酸,结果表明,第一次修复后可提取的有机污染物降低了70%～90%.也有研究[14]发现胡敏酸能够增加有机污染物的生物有效性,且胡敏酸能够被菌株共代谢,进一步促进污染物的微生物降解.闫端[15]向高质量分数PAHs污染土壤中添加胡敏酸,结果显示PAHs的解吸效果随着胡敏酸质量分数的增加而增加.可见,胡敏酸与有机污染物的相互作用对于土壤有机污染物的修复具有十分重要的意义.

目前,关于不同腐殖质组分对土壤中DnBP的降解动力学及土壤微生物活性方面的研究尚鲜见报道.本文以DnBP为PAEs的代表污染物,采用土壤培养试验,研究了腐殖质重要组分HA对污染土壤中DnBP的降解动力学过程、土壤基础呼吸强度和土壤酶活性的影响规律,以期为PAEs在土壤中的降解行为及其污染土壤生物修复提供理论基础和数据依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自辽宁省沈阳市新民蔬菜基地农田,采样点地理坐标为E41° 48′41″;N122°50′47″;采样深度为0～20 cm.将土壤样品充分混合均匀,自然风干,研磨过2 mm筛,保存备用.土壤类型为潮棕壤,经测定,土壤pH值为5.810,有机质质量分数为3.010%,总氮质量分数为0.210%,总磷质量分数为0.024%.

供试胡敏酸(HA)购于南京都莱生物技术有限公司;DnBP标准溶液(1 000 μg·mL-1)购于百灵威科技有限公司;所用丙酮、二氯甲烷、正己烷等有机试剂购于康科德有限公司,均为色谱纯试剂,且经色谱检验无杂峰;无水硫酸钠(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司,在马弗炉中于400 ℃条件下烘干4 h;玻璃器皿均用重铬酸钾洗涤液浸泡、洗净后于450 ℃烘4 h,备用.

1.2 污染土壤制备

分别向每份50 g的土壤中加入不同质量的HA,使土壤中HA的质量分数为10、20、40、80和160 mg·g-1(分别记作H1、H2、H3、H4、H5).充分混合均匀;同时设不含HA的对照处理组(CK).

将一定量DnBP溶于丙酮中,配成质量浓度为2 mg·mL-1的DnBP丙酮溶液,然后按每kg土壤50 mL的比例添加到土壤中,充分混合均匀,放在通风橱内风干7 d,待丙酮自然挥发后,再次充分混合均匀,分装.同时保留一份50 g左右不加DnBP丙酮溶液的空白土壤于纸袋中.土壤中DnBP处理质量分数为100 mg·kg-1.

1.3 土壤培养实验

准确称取(15.000±0.005) g土壤样品于250 mL三角瓶中,将土壤样品均匀平铺于锥形瓶底部,按最大持水量60%加入纯水.然后用铝箔纸封口,在铝箔纸中央打孔,放入恒温恒湿培养箱中避光培养.培养条件为:温度25 ℃、湿度80%,定期充分补水,维持土壤含水量.

分别于试验第0、5、10、15、20、25、30、35、40 d将三角瓶用带有双通阀的胶塞密封,密闭培养24 h,采集气体样品,用于土壤呼吸强度分析.同时采集土壤样品,用于土壤酶活力测定和土壤中DnBP质量分数分析.将土壤置于纸袋中,于冰箱中4 ℃冷藏保存,3 d内完成土壤酶活测定;DnBP质量分数测定前将土壤于室温风干,过孔径为850 μm(20目)筛,冰箱冷冻保存,备测.

1.4 样品分析

土壤中DnBP提取采用超声波提取法[16],提取液中DnBP质量分数分析采用气相色谱法进行[17-19].色谱分析条件为:进样口温度250 ℃,检测器温度为300 ℃.柱升温程序:150 ℃保持0.5 min;以5 ℃·min-1的速率升温至220 ℃;以3 ℃·min-1的速率升温至255 ℃;以30 ℃·min-1的速率升温至280 ℃.保持10 min,载气流量为1.2 mL·min-1.不分流进样模式,进样体积为1 μL.以3倍信噪比作为方法检出限,DnBP的检出限为0.01 mg·kg-1.DnBP加标回收率为84.330%～94.420%,土壤空白和试剂空白中目标化合物低于检出限,满足分析要求.

气体样品中CO2释放量分析采用GC-FID法进行[20],气相色谱仪为CP-7890B(Agilent, USA),色谱柱为Col2:SS-2 m×2 mmPorapak Q(60/80目),检测器温度为250 ℃,驻箱温度为55 ℃,转化器温度为375 ℃.土壤脱氢酶的测定采用TTC还原法[21];土壤过氧化氢酶的测定采用高锰酸钾滴定法[22].每个不同HA质量分数土壤处理设置3个平行样品.

1.5 数据分析

采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析,采用最小差数法(LSD)进行差异显著性分析,采用Microsoft Excel进行通径分析,采用Original 8.5.1进行动力学曲线拟合及制图.

2 结果与分析

2.1 DnBP在土壤中的降解动力学

将DnBP在土壤中的降解动态数据进行拟合,发现其在土壤中的降解动力学符合一级反应动力学模型(见图1),动力学方程及相关参数列于表1.如表1所示,DnBP的一级降解动力学方程的相关系数(R2)均大于0.9,表明该拟合方程能够准确描述土壤中DnBP残余量与培养时间的关系.由表中数据可以看出,对照处理组(CK)土壤中DnBP降解的半衰期为5.069 d,添加不同质量分数HA各处理组的DnBP降解的半衰期为2.833～4.532 d,约为CK的0.559～0.889倍.H1～H4处理,DnBP在土壤中的半衰期随HA质量分数的增加而缩短,而当HA的质量分数进一步增加时(H5),DnBP的降解半衰期出现了增加的趋势.这表明HA的添加促进了土壤中DnBP的降解,且具有明显的质量分数效应,当HA添加质量分数过高时,DnBP降解速率减慢.Cervantes等[23]研究表明,在还原态腐殖质存在的情况下,可以较好地降解苯酚、甲酚和石碳酸等污染物;李丽等[24]试验证明,腐殖质的存在加速了PAHs的降解和提高了微生物聚生体的矿化速率;这与本文研究结果相一致.

图1 不同质量分数HA处理后DnBP在土壤中的降解动力学曲线Fig.1 Degradation kinetics of DnBP in soil after HA treatment

表1 土壤中DnBP的降解动力学方程
Table 1 The kinetic equation of DnBP degradation in soil

土壤中HA添加量动力学方程半衰期/d相关系数(R2)CKlnCt=4.54773-0.13674t5.0690.903H1lnCt=4.48193-0.16047t4.5320.938H2lnCt=4.46049-0.17007t4.0760.960H3lnCt=4.43475-0.18718t3.7030.971H4lnCt=4.43960-0.24463t2.8330.995H5lnCt=4.45544-0.22322t3.1050.989

注:t为培养时间,d;Ct为培养t时间时土壤中DnBP的质量分数,mg·kg-1.

2.2 HA对土壤呼吸强度的影响

图2为不同质量分数HA处理后土壤呼吸强度(CO2释放量)随培养时间的变化.如图2所示,空白对照组(CK)土壤呼吸强度始终保持较低水平,随培养时间的延长呈现先快速增大而后缓慢减小的趋势.HA处理各组CO2释放量随培养时间的变化规律与CK类似,但HA处理各组土壤呼吸强度均高于对照组,说明HA的添加促进了土壤的基础呼吸.在培养第5～10 d,CO2释放量快速增加,H1～H4处理组随着HA质量分数的增加,CO2释放量也增大;在培养第10 d时,CO2释放量达到峰值,其中,H4组对土壤呼吸强度促进作用最大,约为空白对照组CO2释放量的1.75倍;而后CO2释放量逐渐减少.这可能是由于HA提供了碳源,促进了土壤呼吸的正向进行,碳的分解向土壤中的微生物提供了营养,促进了微生物的生命活动.孟婷婷等[25]将含有较多天然腐殖酸的褐煤添加到黑土中,其结果表明褐煤的加入促进了土壤的基础呼吸,与本试验结果相一致.

图2 不同质量分数HA处理后土壤的呼吸强度CO2释放量随培养时间的变化

Fig.2 Changes in CO2release amount of soil respiration intensity after HA treatment with different mass fractions

2.3 HA对土壤酶活性的影响

2.3.1 HA对土壤过氧化氢酶活性的影响

土壤过氧化氢酶是一种氧化还原酶,与土壤呼吸强度、有机质含量等土壤状况有密切关系,过氧化氢酶(CAT)可促使H2O2分解为分子氧和水,清除过氧化氢,从而使细胞免于遭受H2O2的毒害,是生物防御体系的关键酶之一[26].图3为不同质量分数HA处理后土壤过氧化氢酶活性随培养时间的变化情况.如图3所示,在培养前期(5～10 d),与对照处理组相比,HA处理组过氧化氢酶活性显著高于对照处理组(p<0.05).培养第5 d时,H1～H5处理组的土壤过氧化氢酶活性比对照处理组分别提升了3.205%、3.846%、3.526%、5.128%和5.449%;培养第10 d时,分别提升了1.357%、2.715%、2.262%、2.866%和3.771%,总体上表现出酶活性随HA处理质量分数的增加而增大的特征.然而,随着培养时间的延长,HA处理组与对照处理组之间过氧化氢酶活性的差异减小.HA处理组过氧化氢酶活性随培养时间的变化趋势与对照处理组相似,均表现为5～20 d时酶活性逐渐增加,20～30 d时变化幅度不大,而后酶活性显著降低.蔺浩然等[27]得出不同比例蚯蚓粪配施HA对土壤过氧化氢酶有促进作用.吴炳孙等[26]研究结果表明,施用风化煤HA可提升土壤过氧化氢酶活性.这些研究结论与本研究得出的向土壤中施加HA能够提高土壤过氧化氢酶活性的结果相一致.

图3 不同质量分数HA处理后土壤过氧化氢酶活性随培养时间的变化Fig.3 Change of soil catalase activity with different culture time after HA treatment 注: *表示P<0.05,**表示P<0.01(Pearson相关,双侧).

2.3.2 HA对土壤脱氢酶活性的影响

土壤脱氢酶是各种代谢反应的常用酶,借助于有机物的氧化反应制造能量,体现了土壤微生物的整体活性,可以评估微生物的氧化还原能力,能够反应出土壤微生物对有机物的降解能力的高低.图4为不同质量分数HA处理后土壤脱氢酶活性随培养时间的变化情况.如图4所示,在培养前期(5～15 d),与对照处理组相比,多数HA处理组脱氢酶活性显著高于对照处理组(p<0.05).在培养第10 d时,HA处理组脱氢酶活性达到最大,H1～H4处理表现出酶活性随HA处理质量分数的增加而增大的特征,而当HA用量进一步提高(H5),土壤脱氢酶活性有所降低.然而,随着培养时间的延长,HA处理组与对照处理组之间土壤脱氢酶活性的差异减小,这一变化趋势与HA质量分数对土壤过氧化氢酶活性的影响规律相似.袁婉潼[28]的研究结果也表明不同质量分数生物腐殖酸能提高土壤酶活性,中量腐殖酸对脱氢酶活性提高作用最好,高量腐殖酸次之.这说明土壤酶活性与HA之间具有明显的量效关系,适量施用HA对土壤酶活性的提高有利,而过量施用并不能取得较为理想的效果.

图4 不同质量分数HA处理后土壤脱氢酶活性随培养时间的变化Fig.4 Changes of soil dehydrogenase activity with different culture time after HA treatment 注: *表示P<0.05,**表示P<0.01(Pearson相关,双侧).

2.4 HA用量、土壤酶活性及呼吸强度与DnBP微生物降解的相关性

HA用量与土壤中DnBP降解率、土壤呼吸强度及土壤酶活性之间的相关系数如表2所示.可以看出,土壤中DnBP的降解率与土壤呼吸强度、土壤过氧化氢酶活性之间表现出极显著正相关关系,与土壤脱氢酶活性之间呈显著正相关关系;而HA用量与土壤脱氢酶活性之间呈显著正相关关系;土壤脱氢酶活性与土壤呼吸强度之间也表现为显著正相关关系.土壤中DnBP降解率与HA用量、土壤呼吸强度、土壤酶活性之间的通径系数如表3所示.通径分析结果显示,土壤呼吸强度和过氧化氢酶与土壤中DnBP降解率之间的直接通径系数和综合通径系数均较大,说明其直接作用明显,并最终表现出强烈的综合正向作用.HA用量对土壤中DnBP降解率直接通径系数为-0.035,综合通径系数为0.112,说明其直接作用不明显;但通过其与土壤呼吸强度、过氧化氢酶、脱氢酶之间的相互作用最终表现为间接正向作用.Steiner 等[29]的研究结果表明,HA存在条件下,对土壤呼吸和土壤酶有激励作用,与本实验研究结果一致.

表2 HA用量与土壤中DnBP降解率、土壤呼吸强度及土壤酶活性之间的相关系数Table 2 Correlation analysis between soil DnBP and soil enzyme activity and respiration intensity

注: *表示P<0.05,**表示P<0.01(Pearson相关,双侧).

表3 土壤中DnBP降解率与HA用量、土壤呼吸强度、土壤酶活性之间的通径系数Table 3 Path coefficient of HA dosage, respiration intensity and soil enzyme activity on the degradation rate of DnBP in soil

上述分析结果说明HA的施加促进了土壤微生物活动,土壤脱氢酶活性、土壤过氧化氢酶活性和土壤呼吸强度的增加,使菌群的氧化还原能力增强,从而加快了土壤中DnBP的降解速率,缩短了DnBP在土壤中的半衰期.这可能主要基于两方面原因:一方面,HA进入土壤后,土壤外源碳含量增加,外源碳的分解向土壤中的微生物提供了营养,促进了微生物的生命活动[30],从而促进了土壤中DnBP的降解;另一方面,HA的分子中存在大量羧基、醇羟基、酚羟基、醌型羟基和酮型羟基等活性官能团[31],这些活性官能团与土壤中DnBP能够发生吸附-解吸等相互作用[32],从而能够改善土壤微生物活性及其对土壤中DnBP的降解功能.如Chai等[33]报道腐殖质对PAEs的吸附能力与PAEs的性质有关,腐殖质与PAEs之间的吸附主要以非特异的疏水作用为主;Gao等[34]研究发现胡敏酸对DnBP的吸附等温线符合Freundlich模型,其吸附能力随着温度和pH值的上升而下降;万洋[32]研究表明胡敏酸能够与DnBP形成复合物.