夹竹桃花挥发油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶对夹竹桃花的增香和豚鼠离体子宫平滑肌的作用

2020-05-02刘语刘铮铮宋宁南冠君杨广德

中国林副特产 2020年2期

刘语, 刘铮铮, 宋宁, 南冠君, 杨广德

(西安交通大学药学院，西安 710061)

夹竹桃(NeriumindicumMill.)，为龙胆目夹竹桃科夹竹桃属常绿直立大灌木，原产于伊朗、印度、尼泊尔等地。中国各省区均有栽培，尤以中国南方为多[1-2]。其性味苦、寒，有毒[1]，毒性成分为各种夹竹桃甙，主要毒性成分是强心甙[1]，在医药上用于强心药。具有较高的药用价值和观赏价值。

夹竹桃具有强心利尿、发汗催吐、镇痛作用[2]。夹竹桃花大、艳丽、花期长，常作观赏。夹竹桃花也是一种较理想的酸碱指示剂[3]，其花外涂可以治疗口腔溃疡[4]。夹竹桃花乙醇提取物对菜粉蝶幼虫的拒食作用和对其成虫的产卵忌避作用均较显著[1]、夹竹桃花乙醇粗提物对蚜虫的致死作用较明显[5]。其花、叶、根皮的植物提取液具有较高的杀线虫作用[6]。

有文献对黄花夹竹桃的药理作用进行研究发现其具有强心作用，能使子宫肌张力增加[7]。有研究发现红白两种夹竹桃成分不同，含量不同，生理作用也不同[2]。

β-葡萄糖苷酶，它能够水解多种β-葡萄糖苷，同时释放出葡萄糖和相应的配基[8-9]。β-葡萄糖苷酶来源广泛，其酶学性质变化不一，即使同一种生物，特别是高等作物，其体内的β-葡萄糖苷酶存在多种形式，性质也存在较大的差异[10-11]。近年来，β-葡萄糖苷作为风味酶的应用已日益受到人们的重视，其中尤以其对果汁、果酒和茶叶的增香研究较多，而有关β-葡萄糖苷酶酶解植物香料的增香报道甚少[12]，也用于植物有效成分的提取[13-15]。

本文将结合GC-MS对夹竹桃花挥发油成分进行分析，为以后夹竹桃花的研究提供可科学依据，利用β-葡萄糖苷酶水解夹竹桃花，以验证β-葡萄糖苷酶对其是否具有增效作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器GCMS-TQ8040型气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)；AY120电子天平(日本岛津公司)；BLG420S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；JH-2型张力换能器(成都泰盟科技有限公司)；HW-400E型恒温水浴平滑肌槽(成都泰盟科技有限公司)；挥发油提取器(无锡久平仪器有限公司)。

1.2 动物雌性豚鼠体重250～280 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。

1.3 试药夹竹桃花采于2018年7月采自西安交通大学药学院的药园，由西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为唇形科植物夹竹桃(NeriumindicumMill.)的花；正己烷，色谱纯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；无水硫酸钠，分析纯(西安化学试剂厂)；二甲基亚砜，分析纯(西安化学试剂厂)；缩宫素注射液(南京新百药业有限公司，国药准字 H32025280，规格：10 U/mL，使用时用生理盐水配成1 U/mL)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，规格：1 mg/片，使用时用纯水配成 0.8 mg/mL)。

2 方法与结果

2.1 β-葡萄糖苷酶水解反应

分别称取两份200 g新鲜夹竹桃花于500 mL pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，其中一份加0.2 g β-葡萄糖苷酶，同时置于摇床中50 ℃恒温水浴5 h。同法制备空白溶液。

2.2 挥发油的提取

分别置于2000 mL圆底烧瓶中，加水800 mL，沸石数粒，摇匀，按2015版《中国药典》四部通则2204挥发油测定法甲法提取挥发油，保持微沸4 h。读取挥发油体积并收集所得挥发油，加入少量无水硫酸钠，静置。然后，称取夹竹桃花挥发油适量，加正己烷溶解并稀释，待测(用于GC-MS分析)。称取夹竹桃花挥发油适量，临用前用DMSO配成0.1 g/mL(用于豚鼠离体子宫试验)。未加β-葡萄糖苷酶处理所提取的夹竹桃花挥发油为挥发油(1)，加β-葡萄糖苷酶处理后提取的夹竹桃花挥发油为挥发油(2)。

2.3 GC-MS的色谱条件

采用SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱；载气：He(≥99.99 %)；流速：1 mL/min；进样口温度：250 ℃；分流比：5∶1；升温程序：色谱柱始温60 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升温至150 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温至200 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升温至280 ℃，保持1 min；质谱：接口温度为250 ℃，离子源温度：230 ℃，电子轰击源EI，电子能量：70 eV，质量扫描范围：45～550 m/z；溶剂峰切除时间为2.5 min，质谱检测起始时间为3.0 min。进样量1.0 μL。

2.4 数据处理

所得的色谱和质谱信息经数据处理系统与其内存谱库(NIST)自动检索和解析，并用峰面积归一法测定了各化学成分在挥发油中的相对百分含量。

3 结果

3.1 GC-MS分析

采用GC-MS对夹竹桃花的挥发油提取物进行分析，其有酶、无酶的情况下总离子流图结果见图1和图2。

图1 无酶夹竹桃花挥发油(1)的GC-MS总离子流图

通过分析比较，确定色谱条件筛选后的GC-MS法对色谱峰可以达到较好的分离。通过计算机谱库检索及核对质谱图，β-葡萄糖苷酶水解前后的夹竹桃花挥发油提取物的化学成分分析见表1。

图2 有酶夹竹桃花挥发油(2)的GC-MS总离子流图

续表1

保留时间/min化合物中文名称分子式相对峰面积(%)有酶挥发油(2)无酶挥发油(1)52.673十五醛C15H30O1.651.7753.5303,7,11-三甲基-1-十二烷醇C15H32O1.611.4454.804肉豆蔻酸C14H28O21.17-55.662苯甲酸辛酯C15H22O20.350.2256.540正二十一烷C21H441.412.6057.116十六醛C16H32O5.126.18

经GC-MS分析并结合NIST谱库检索，鉴定出无酶夹竹桃花挥发油58种化合物，有酶夹竹桃花挥发油57种化合物。由表1可知，在有酶夹竹桃花挥发油提取物中含有许多烷类和醛酮类物质，其主要物质为2,6,10-三甲基十三烷(24.58%)、壬醛(18.55%)、十一烷(10.58%)、十六醛(5.12%)、十四醛(4.72%)。与无酶夹竹桃花挥发油提取物相比新增加了顺式-3-己烯-1-醇(0.11%)、月桂酸(0.77%)、肉豆蔻酸(1.17%)三种化合物，减少了α-蒎烯、β-蒎烯、对伞花烃、十三醛、异蛇床酞内酯五种化合物。这些物质在无酶夹竹桃花挥发油提取物中的含量分别为0.70%、0.13%、0.50%、1.82%、0.78%。

无酶夹竹桃花挥发油提取物中所含化合物的主要成分与有酶相比类似，含量稍微有所不同，分别为：2,6,10-三甲基十三烷(24.62%)、十一烷(15.86%)、十六醛(6.18%)、十四醛(5.95%)、壬醛含量较小为0.44%。

通过表1的对比，可知在夹竹桃花中β-葡萄糖苷酶存在作用。对比可知在加入β-葡萄糖苷酶后壬醛、邻二甲苯、正己醇、4-甲基庚醇、愈创木酚、水杨酸甲酯等物质的相对含量也有所增加。同时可以观察到正辛烷、庚醛、桉叶油醇、苯乙醛、十一烷、2,6,10-三甲基十二烷、癸醛、正十七烷等物质的相对含量降低。

同时通过对夹竹桃花挥发油的成分分析，发现加入酶之后除少数物质，如壬醛、邻二甲苯之外，大部分物质都降低，增加了与增香作用有关的肉豆蔻酸、月桂酸、顺式-3-己烯-1-醇。而与增香作用有关的了ɑ-蒎烯、β-蒎烯、对伞花烃、十三醛减少，甚至消失。但其含量均较低。而与增香作用有关的壬醛大幅度增加，含量较高，且增加的肉豆蔻酸等与增香作用有关，且含量较高。故推测于β-葡萄糖苷酶的加入，对夹竹桃花有较弱增香作用。

3.2 豚鼠离体子宫试验[7,16-17]

取健康、成年雌性未孕豚鼠，在实验前2 d，每天按8 mg/kg灌胃戊酸雌二醇溶液，复制动情期豚鼠模型。于实验第3 d，颈椎脱臼处死豚鼠并迅速剖取子宫，置于盛有洛氏液(取NaCl 9.2 g、KCl 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g，用生理盐水制备成1 000 mL的溶液，即得)的玻璃皿中，轻轻剥离子宫上附有的结缔组织和脂肪组织，然后取中间段子宫平滑肌2～3 cm。

将离体子宫平滑肌一端固定于盛有洛氏液20 mL的浴槽，另端与张力换能器相接，保持浴槽中的营养液温度为(37±0.5)℃，并通以95% O2+5% CO2的混合气体，速度为1～2个小气泡/s，用BLG420S生物机能实验系统先记录一段正常曲线后，分别加入缩宫素、挥发油(1)和挥发油(2)，则浴槽内药物终浓度为：缩宫素0.002 U/mL、挥发油(1) 0.06 mg/mL，挥发油(2) 0.06 mg/mL。空白对照组浴槽中加入等体积DEMO。每次给药后记录10 min子宫收缩曲线，然后用洛氏液清洗3次，待子宫活动再次稳定后，给予下一组药物。比较子宫收缩张力。试验重复10次。结果见表2。