胶体金免疫层析法检测SARS-CoV-2血清抗体的临床价值探讨*

邓杰伦，王远芳，王婷婷，黄学东，吴思颖，王旻晋，李冬冬,陶传敏，谢 轶，应斌武

(四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041)

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是人畜共患的正单链RNA病毒，有包膜，属冠状病毒科。该科分为α、β、δ和γ四个属，SARS-CoV-2属于β属，被列为第7类冠状病毒，可引起新型冠状病毒性肺炎(COVID-19)[1]。临床表现多为发热、乏力，或有呼吸道症状。已明确可以人传人，人群普遍易感。早发现、早诊断、早隔离是有效控制COVID-19疫情的关键[2]。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第6版)》[3]中明确指出COVID-19确诊需具有以下病原学证据之一：(1)实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；(2)病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。核酸检测具有早期、灵敏、特异度高等优势[4]，但也存在一定局限，因此需要探索快速有效、便捷可行的临床检测方法，以补充核酸检测的不足[5]。本研究主要应用胶体金免疫层析法(GICA法)检测SARS-CoV-2 IgM和总抗体(即IgM/IgG)并探讨该项目在临床应用的价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2020年1月25日至2月22日入院的确诊和疑似COVID-19的76例患者，共计83份血清标本。 32例SARS-CoV-2核酸阳性患者为确诊组，其中7例患者有两份标本，其余患者为一份标本；44例SARS-CoV-2病毒核酸阴性者为对照组，所有患者均为一份标本。

1.2 试剂 GICA检测试剂盒为北京热景生物技术股份有限公司提供的SARS-CoV-2 IgM检测试剂盒和SARS-CoV-2总抗体检测试剂盒。

1.3 方法 IgM检测采用捕获法，总抗体检测采用双抗原夹心法，形成胶体金复合物，直接肉眼判读。操作人员按照生物安全三级实验室的标准进行个人防护，标本检测在二级生物安全实验室中进行。标本3 000 r/min离心10 min后，离心机内静置15 min取出，二级生物安全柜内开盖。进行IgM检测时，取100 μL待检血清稀释后滴加检测孔。总抗体检测时，取50 μL待检血清，滴加检测孔。均于15～30 min后观察结果。

1.4 抗体出现时间评估 以确诊患者出现症状为起点，送检标本中检测到抗体的日期为终点，对抗体出现时间进行评估。

2 结 果

2.1 GICA法检测血清SARS-CoV-2 IgM和总抗体结果 SARS-CoV-2 IgM检测灵敏度50.00%(16/32)，特异度90.91%(40/44)，符合率73.68%(56/76)，阳性预测值80.00%(16/20)、阴性预测值71.43%(40/56)。SARS-CoV-2总抗体检测灵敏度68.75%(22/32)、特异度97.73%(43/44)、符合率85.53%(65/76)、阳性预测值95.65%(22/23)、阴性预测值81.13%(43/53)。见表1。

表1 GICA法检测血清SARS-CoV-2 IgM和总抗体结果(n)

2.2 7例患者两个时间点SARS-CoV-2IgM和总抗体检测结果 对7例患者两次采样的标本进行检测，其中2号、4号、5号、6号患者在第2次检测时IgM检出阳性；1号、2号、4号、6号患者在第2次检测时总抗体检出阳性。见表2。

表2 7例患者两个时间点SARS-CoV-2IgM和总抗体检测结果

注：+为阳性，-为阴性。

2.3 患者血清SARS-CoV-2 IgM和总抗体检出时间评估及阳性率比较 通过对15例住院患者的共计22份血清标本抗体检出时间进行分析，IgM检出时间为发病后7～20 d，中位数为13 d；总抗体检出时间为发病后3～20 d，中位数为12 d,不同检出时间患者血清SARS-CoV-2 IgM和总抗体阳性率比较见表3。

表3 不同检出时间患者血清SARS-CoV-2 IgM和总抗体阳性率比较[n(%)]

3 讨 论

病毒核酸检测作为COVID-19确诊标准，具有灵敏度高、特异度好、可早期诊断等优点[4]。用于核酸检测的COVID-19标本多为鼻咽拭子，采样不规范或者未取到病毒细胞容易造成漏检[6]。核酸检测对实验室条件要求较高、操作繁琐、检测流程时间长[7]，因此探索更快、更便捷的检测方法是当前疫情防控中的重要任务。抗体检测作为感染病的间接证据可作为临床诊断或回顾性诊断依据。参考重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的研究[8]，特异性SARS-CoV IgM产生时间比普通病毒特异性IgM滞后1周左右，30～40 d抗体滴度达峰，180 d基本转阴；SARS-CoV IgG在体内阳性率维持时间长，至发病150 d阳性率仍在90%左右；也有报道称SARS-CoV IgG在发病2年后阳性率仍维持在90%左右[9]。在本研究中GICA法检测SARS-CoV-2抗体，以全血为标本，容易统一标本质量。实验操作简单，检测时间短，无需特殊设备，易推广。SARS-CoV-2感染后，患者在核酸转阴后抗体亦可继续存在，因此抗体检测对于SARS-CoV-2疫情的回顾性诊断和流行病学调查具有重要意义[10]。

本研究中GICA法检测IgM和总抗体的特异度均大于90%，与核酸特异性相近[5]。检测方法符合率，阳性预测值和阴性预测值均高于70%，能够满足临床要求。然而，GICA法检测IgM和总抗体的灵敏度较低,为50%～68%。据其他研究报道，流感病毒抗原胶体金检测方法的灵敏度为55.60%，特异度为75.90%[12]。SRAS-CoV IgM 的灵敏度是52.80%,特异度是99.40%,符合率 78.82%。IgG的灵敏度是73.23%,特异度是 98.10%,符合率87.15%[13]。因此，抗原-抗体检测方法灵敏度低、特异度高的特点较为显著。抗原-抗体检测灵敏度较低的原因可能与标本采集时间点和抗体产生的生理过程相关。本研究中，SARS-CoV-2在发病11 d后，IgM检测的阳性率逐渐升高，由此推测IgM检测的最优时间点为发病后第11天，而核酸检测的最佳时间为3～5 d[9]，可见核酸检测时间更早。SRAS-CoV感染后发病后第11～20天的血液中检测特异性IgM阳性率升高，与SARS-CoV-2抗体检测时间相近。抗体产生可能与病毒感染机体的特殊致病机制、潜伏期等因素有关[10-11]。

抗原刺激后，人体中出现最早的抗体是IgM，IgG一般晚于IgM出现。本研究通过分析15例住院患者发病时间及病程，发现在整个研究过程中，总抗体的阳性率均高于IgM。可能原因：(1)从方法学角度总抗体检测采用双抗原夹心法，IgM检测采用捕获法，双抗原夹心法灵敏度高于捕获法，所以当样本中抗体滴度较弱时，可能出现单独IgM试剂未能检出，总抗体试剂可检出的结果；(2)本试剂总抗体包被片段为S-SRBD+N，以S全长+N全长标记，检测样本中的IgM和IgG抗体；IgM仅以S全长+N全长包被，检测样本中的IgM；总抗体检测位点较IgM多，所以当样本中的IgM产生其他位点时亦能检出，并且总抗体检测覆盖感染早期和后期，而IgM仅覆盖感染早期。本研究对照组中有4例患者IgM检测结果呈现假阳性，其中1例患者总抗体检测也呈现假阳性，可能是由于在检测过程中受到了其他免疫分子的干扰[13]。抗体检测差异和假阳性可能与试剂盒本身检测差异有关，也可能与SARS-CoV-2的感染机制有关，有待进一步研究。本研究仅为初步探索，纳入病例数较少，且样本连续性不足。随着疫情的进展，可采集不同时间点样本对比分析，以研究COVID-19的抗体消长规律。

4 结 论

综上所述，GICA法检测SARS-CoV-2抗体，可以作为SARS-CoV-2感染检测的方法之一。目前尚不能替代核酸确诊检测，但在未及时获得核酸检测结果时，可对SARS-CoV-2感染情况提供参考价值。在COVID-19疫情防控过程中，仍然需要大量的抗体检测数据以推动COVID-19的流行病学调查。