FFA上调AMPK/ Vimentin促进前列腺癌细胞PC-3的增殖、侵袭和迁移

陈柯茹，王竞州，王翠喆，唐慧，哈晓丹，邓玉春，张雪婷，李雪，冯家乐，谢建新，张君*

(1石河子大学医学院/新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002；2石河子大学科研处，新疆 石河子 832002)

前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是最常见的男性泌尿系统恶性肿瘤，居男性恶性肿瘤发病率第二位，致死率第五位[1]。肥胖是PCa发生发展的重要危险因素之一，并且与PCa的恶性程度密切相关。肥胖后，体内过多的游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)蓄积与PCa发生密切相关[2]，而FFA导致前列腺癌发生的具体机制尚不十分明确。

肥胖引起体内FFA升高引起能量代谢异常，最终导致前列腺癌的发生和发展[3]。作为细胞能量代谢的调节器，磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)能够感受细胞内AMP浓度及AMP/ATP的比值变化，通过一系列复杂而精准的调节机制维持能量代谢平衡[3]。AMPK在不同肿瘤发生发展中发挥不同的作用。

有文献报道，AMPK具有一定的促血管生成和促肿瘤细胞生长的功能，同时，也有研究表明AMPK通过抑制TSC-mTOR信号通路，发挥抑癌的作用[4]。AMPK的活化，能够抑制结肠癌细胞系SW480的增殖、侵袭和迁移[5]。AMPK在前列腺癌的发生发展过程中具有促癌和抑癌的双重作用。

Tennakoon J B等[6]发现，雄激素可以与AMPK-PGC-1α信号级联反应(一种已知的稳态机制)的协同作用，促进前列腺癌细胞的生长。亦有文献表明，新型的AMPK激活剂可通过阻止脂肪生成来抑制前列腺癌细胞的生长[7]。AMPK是否在肥胖条件下导致FFA水平升高，继而在促进前列腺癌发生发展的过程中发挥作用，尚未见文献报道。

本研究通过探讨FFA对人前列腺癌细胞PC-3生物学行为的影响及可能机制，将为阐明肥胖相关前列腺癌发生发展的分子机制，以及临床预防提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 FFA混合液的配制

用DMSO(Sigma，美国)分别将油酸(OA) (Sigma，美国)和棕榈酸(PA) (Sigma，美国)稀释为0.67 mol/L和0.33 mol/L的母液,4 ℃保存。将油酸(OA)和棕榈酸(PA)按 2∶1制成混合液。用含有1% BSA(中杉金桥，北京)的培养基调配成使用前所需的浓度。

1.2 人前列腺癌细胞PC-3的体外培养及生物学行为的检测

1.2.1 人前列腺癌细胞PC-3的体外培养

人前列腺癌细胞PC-3购自中国科学院上海细胞库。PC-3细胞在10%胎牛血清(Biological Industries，以色列)+F12培养液(Life technologies,美国)+1%青霉素-链霉素(Life technologies,美国)条件下，于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养。

1.2.2 游离脂肪酸筛选

采用F12基础培养基重悬PC-3细胞后，将细胞悬液以每孔1.5×104个细胞接种于96孔板，每组设置3个平行孔，将FFA混合液的母液与PC-3培养基按不同比例配制成不同浓度的FFA混合液(0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mmol/L)刺激PC-3细胞，于37°培养箱中常规培养24 h，再加入10 μL的CCK8 (北京同仁化学研究所)和100 μL F12基础培养基混合后，移入每个细胞孔中，培养箱孵育3.5 h，在酶标仪(Bio-Rad公司xMarkTM，美国)上读取各孔的OD值，波长为450 nm。实验重复3次。

1.2.3 细胞周期测定

收集各实验组的PC-3细胞，移入预冷的75%乙醇中，4 ℃固定过夜。PBS洗涤2遍，离心5 min，弃上清，尽量吸净。每管样品中加入500 μL PI/RNase Staining Buffer(Life technologies,美国)使其重悬细胞，4°冰箱避光孵育30 min。置于流式细胞仪(Thermo Fisher,美国)进行细胞周期检测。

1.2.4 细胞侵袭实验

采用8 μm孔径的Transwell小室(corning，美国)置于24孔板(corning，美国)上方，将Matrigel基质胶(Solarbio，北京)均匀平铺于Transwell小室的底部，且无气泡，37 ℃培养箱孵育2 h，用无血清F12培养基将各组实验的PC-3细胞(3×104个/室)制成细胞悬液，移至Transwell小室的上室，下室为含10% FBS的F12培养基。常规培养24 h或48 h后取出小室，弃去上室液体，PBS清洗，4%福尔马林 (Solarbio，北京)固定30 min，再次PBS清洗，用吉姆萨(Solarbio公司，北京)染色5 min，PBS清洗，用棉签将上室内部未侵袭的细胞擦去，晾干后置于载玻片上，在倒置显微镜(Axio Observer A1，德国)下随机选取6个视野，使用Image J软件(NIH Bethesda，美国)统计细胞侵袭数目。实验重复3次。

1.2.5 细胞迁移实验

采用8 μm孔径的Transwell小室置于24孔板上，不加Matrigel基质胶，用不含血清的F12培养基将上述各组PC-3细胞(3×104个/室)制成细胞悬液，移至Transwell小室的上室，下室是含10% FBS的F12培养基。常规培养24 h或48 h后取出小室，弃去上室液体，PBS清洗，4%福尔马林 (Solarbio，北京)固定30 min，PBS清洗，用棉签将上室内未侵袭的细胞擦去，PBS清洗，用吉姆萨染色5 min，晾干后置于载玻片上，在倒置显微镜下随机选取6个视野，使用Image J软件(NIH Bethesda，美国)统计细胞迁移数目。实验重复3次。

1.3 AMPK的过表达和干扰

1.3.1 AMPK的过表达

取对数生长期PC-3细胞用无抗生素的培养基重悬后接种于6孔板，置于常规培养箱中培养过夜，细胞密度约为60%～70%时方可进行转染,具体操作参照 Lipofectamine3000(Life technologies,美国)说明书进行，实验分为3组：转染AMPK(pcDNA3.1) (购自中国苏州吉玛因股份有限公司)的细胞为 Ad-AMPK组，转染空载质粒组为阴性对照组，未转染组为空白对照组。将上述各组细胞移至常规培养箱中继续培养，转染后4 h 换液，转染48 h后进行后续实验。

1.3.2 AMPK干扰

取对数生长期PC-3细胞用无抗生素的培养基重悬后接种于6孔板，置于常规培养箱中培养过夜，细胞生长密度约为60%～70%时方可进行转染，具体操作步骤参照 Lipofectamine3000说明书进行，实验分为四组：转染AMPK siRNA(购自中国苏州吉玛因股份有限公司)的细胞为 si-AMPK组，FFA混合液处理的同时转染AMPK siRNA为FFA+ si-AMPK组,转染随机序列组为阴性对照组，未转染组为空白对照组。将上述各组细胞移至常规培养箱中继续培养，转染后4 h 换液，转染48 h后进行后续实验。

1.4 关键基因表达的检测

1.4.1 实时定量PCR

使用TRIZOL(life technologies，美国)试剂裂解细胞提取细胞总RNA。反转录体系每20 μL体系使用RNA 5 μL最终得到cDNA20 μL；反转录仪(Eppendorf AG,Germany)程序设置：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。使用qRT-PCR仪(ABI公司7500 Fast，美国)进行检测mRNA表达水平。qRT-PCR程序如下：95 ℃ 4 min，45个循环：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,70 ℃ 40 s。AMPK序列为5′-TTGAAACCTGAAAATGTCCTGCT-3′,5′-CAGGGATGAGTTCGGCACTT-3′;Vimentin序列为5′-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3′，5′-CATTTCACGCATCTG GCGTTC-3′；VEGF序列为5′-GCTTGTCAACTGCGGTTGC-3′，5′-TCCGAGAGATG AGTCAAGAGG-3′；GAPDH序列为5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAA-3′；干扰片段AMPK-homo-330序列为5′-GAGGAGAGCUAUUUGAUUATT-3′，5′-UAAUCAAAUAGCUCUCCUCTT -3′。

1.4.2 Western blot

使用含1%PMSF(索莱宝科技有限公司，北京)和RIPA(索莱宝科技有限公司，北京)裂解液裂解细胞，提取细胞内总蛋白。蛋白样品和4×loading buffer(Thermo公司，美国)按3∶1混合，100 ℃干预锅处理10 min。10% SDS-PAG进行电泳，将蛋白转到NC膜、用BSA封闭2 h，以β-actin为内参，一抗使用小鼠抗β-actin 36 kDa (中山金桥，中国)，AMPK 63 kDa (Abcam)工作浓度均为1∶1000；4 ℃ 冰箱敷育过夜；TBST洗膜，分别使用对应的二抗(中山金桥，中国)工作浓度均为1∶10000室温下培育2 h；TBST洗膜，配制化学发光液，使用ECL化学发光仪(ProteinSimple公司,美国)检测系统进行可视化蛋白质(FluorChem HD2,USA)拍照，Photoshop软件图像处理。

1.5 数据分析

使用SPSS 20.0版软件进行数据统计分析。当数据符合正态分布时，使用两个独立样本t检验评估组间差异。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 高浓度FFA混合液促进PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移，同时可上调AMPK，Vimentin和VEGF的表达

运用细胞计数试剂盒CCK8检测不同浓度FFA混合液(0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mmol/L)对PC-3细胞的毒性作用，结果提示1.5 mmol/L FFA混合液对PC-3细胞的毒性作用最小，可用于后续实验(图1A)。用1.5 mmol/L FFA混合液处理PC-3细胞48 h后，细胞周期实验结果显示：与对照组相比，FFA混合液干预组处于G0/G1期的PC-3细胞数量显著减少，而处于S期的PC-3细胞数量显著增加(P<0.05)(图1B)。Transwell实验结果显示：1.5 mmol/L FFA混合液处理48 h后，PC-3细胞的侵袭和迁移能力显著高于对照组(P<0.05)(图1C)。1.5 mmol/L FFA处理PC-3细胞48 h后，与对照组相比，FFA混合液处理组的AMPK，Vimentin(侵袭迁移相关基因)和VEGF(血管生长因子)的mRNA表达水平均显著增高(P<0.01)(图1D)。

2.2 FFA混合液干预的同时，下调AMPK后，PC-3细胞的生物学行为被抑制， Vimentin的表达降低

FFA混合液干预的同时下调AMPK，细胞周期实验结果表明：与FFA单纯干预组相比，处于G0/G1期和G2/M期数目显著升高，而处于S期的PC-3细胞数目显著降低 (P<0.05)(图2A)。

Transwell实验结果显示，与FFA单纯干预组相比，PC-3细胞的侵袭和迁移能力显著降低(P<0.01)(图2B)。qRT-PCR结果显示：与FFA单纯干预组相比，PC-3细胞中Vimentin的表达显著降低(P<0.01)(图2C)。

注：t检验，*表示P<0.05,**表示P<0.01图2 FFA干预的同时下调AMPK，对PC-3细胞的生物学行为及Vimentin表达的影响

2.3 AMPK可通过调控Vimentin的表达，促进PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移

转染AMPK质粒48 h后，与对照组相比，PC-3细胞内AMPK的 mRNA和蛋白表达水平均显著增高，提示上调AMPK模型构建成功，可用于后续实验(图3A、图3B)。

细胞周期实验结果显示：过表达AMPK后处于G0/G1期的PC-3细胞数目显著降低，而处于S期的PC-3细胞数目显著增加(P<0.05)(图3C)。Transwell实验结果显示：与对照组相比，PC-3细胞的侵袭和迁移能力均显著增加(P<0.01)(图3D)。qRT-PCR结果显示：过表达AMPK可显著促进PC-3细胞Vimentin的表达，而抑制VEGF的表达(P<0.01)(图3E)。

注：*表示与空白对照组相比P<0.05,**表示P<0.01；与阴性对照组相比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；t检验，*表示P<0.05,**表示P<0.01图3 过表达AMPK对PC-3细胞生物学行为及Vimentin和VEGF表达的影响

转染si-AMPK 24 h后，与对照组相比，PC-3细胞内AMPK的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，提示下调AMPK模型构建成功，可用于后续实验(图4A、图4B)。细胞周期实验结果表明：与对照组相比，下调AMPK后处于G0/G1期的PC-3细胞数目显著增加，而处于S期和G2/M期的PC-3细胞数目显著降低 (P<0.05)(图4C)。

Transwell实验结果显示：与对照组相比，PC-3细胞的侵袭和迁移能力显著降低(P<0.01)(图4D)。qRT-PCR结果提示:下调AMPK后，可显著抑制PC-3细胞Vimentin的表达，而VEGF的表达无差异(图4E)。

注：t检验，*表示P<0.05,**表示P<0.01图4 下调AMPK对PC-3细胞生物学行为及Vimentin和VEGF表达的影响

3 讨论

肥胖不仅与高血压、心血管疾病、2型糖尿病及其他代谢性疾病的发生密切相关，还与肿瘤的生长、侵袭和转移等过程存在一定的相关性，是多种肿瘤预后不良的关键因素，而肥胖如何导致肿瘤的发生与进展目前尚不十分明确。

肥胖导致体内FFA含量升高是造成多种肥胖相关肿瘤发生发展的关键。越来越多的研究表明，FFA信号在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，脂肪酸的摄入量与癌症的发生密切相关，在乳腺癌患者血清中总FFA的水平显著高于正常个体。体外实验结果表明，FFA可以促进乳腺癌、胰腺癌细胞增殖并能增加其侵袭力[8-9]。以上研究结果提示：肥胖后脂代谢紊乱导致了血浆FFA水平的增加，FFA作为一种信号分子，可能通过参与肿瘤发生发展相关的信号转导过程，导致肿瘤的发生和发展，此过程的具体作用机制目前尚不十分明确，有待进一步研究。而有关FFA与前列腺癌发生发展的关系，亦成为近年来相关领域研究的热点。有文献报道，油酸通过G蛋白偶联受体FFA1 /GPR40促进前列腺癌的恶性表型[2]。此外，二十二碳六烯酸能够抑制前列腺癌的发生[10]。以上文献提示，不同脂肪酸在前列腺癌的发生发展过程中的作用并不一致，并且其作用的具体分子机制目前尚不十分明确。目前已知，人体内主要包含37种FFA，其中含量最高的为油酸和棕榈酸。本研究将油酸和棕榈酸按2∶1比例配成FFA混合液，处理体外培养的人前列腺癌细胞PC-3，实验结果表明，FFA混合液处理显著增加了PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。提示FFA混合液可促进前列腺癌的发生和发展，但其具体的分子机制有待进一步明确。

AMPK是调节能量代谢的关键分子，与肿瘤的发生发展密切相关，但在不同肿瘤中发挥不同作用，具有抗肿瘤和促肿瘤的双重作用。已有文献报道，AMPK的激活可以抑制胰腺癌细胞的生长[11]。但是，Eung K等[12]发现溶血磷脂酸(LPA)能够激活AMPK，促进卵巢癌的转移。在肿瘤缺氧微环境中，激活AMPK可上调缺氧诱导因子1和VEGF的表达，促进肿瘤局部侵袭和淋巴结转移[13]。在胰腺癌中，抑制AMPK相关蛋白激酶5(ARK5)可降低Vimentin的表达及上皮-间质转化效率，进而提高了吉西他滨对胰腺癌的敏感性[14]。在前列腺癌中，AMPK同样发挥促癌和抑癌的双重作用。已有文献报道，AICAR通过AMPK/mTOR依赖性途径诱导前列腺癌细胞的凋亡并抑制其迁移和侵袭[15]。相反，Jennakoon J等发现雄激素可以配合AMPK-PGC-1α信号级联反应来促进前列腺癌细胞的生长[6]。本研究结果表明：FFA混合液可促进PC-3细胞的AMPK、Vimentin及VEGF表达，提示FFA可能通过促进上述因子的表达增强了PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

为了进一步明确AMPK、Vimentin及VEGF在FFA促进PC-3细胞生物学行为中的相互关系，本研究在用FFA混合液处理PC-3细胞的同时，下调AMPK的表达后发现，FFA混合液对PC-3细胞生物学行为的促进作用，以及对Vimentin的上调作用均被逆转。以上结果提示：高水平的FFA可通过上调AMPK以及Vimentin的表达促进前列腺癌的发生发展。此外，本研究在PC-3细胞中分别上/下调AMPK后发现：AMPK可通过促进Vimentin的表达增强PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移能力。而VEGF的表达则与已有文献不一致，呈现出与AMPK表达负相关的趋势，结合上述FFA促进VEGF的实验结果，提示FFA上调AMPK促进前列腺癌生物学行为可能不是通过VEGF来实现，可能存在其它的分子机制，有待后续研究加以证实。

综上所述，本研究在体外培养PC-3细胞的基础上，发现高浓度的FFA混合液可通过上调AMPK、Vimentin的表达，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力。上述机制的阐明，将为明确肥胖相关前列腺癌发生发展的机制提供新的理论依据，同时为肿瘤的临床治疗提供可能的靶点。