金百麦环境改良剂对猪繁殖与呼吸综合征病毒杀灭效果研究

柒叶荷 黄全奎 周松峰 白云华 赖平生 秦树英 吴健敏*

（1.广西里建桂宁种猪有限公司，广西 南宁，530105；2.北京百净保科技发展有限公司，北京，100093；3.南宁正大畜牧有限公司，广西 南宁，530219；4.广西壮族自治区兽医研究所，广西 南宁，530001）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种在全球范围内广泛传播的猪的重要病毒性传染病，又称猪蓝耳病。其临床症状主要表现为怀孕母猪早产、流产、产死胎和木乃伊胎等，仔猪和育肥猪会出现呼吸道症状，并伴随有间歇性肺炎，病死率较高，是世界范围内造成严重的猪繁殖与呼吸系统疾病的主要病因［1］。PRRSV主要在猪肺泡巨噬细胞（PAM）和树突状细胞（DC）中复制，该病目前无有效治疗药物，死亡率较高，严重影响全球养猪业发展，造成巨大经济损失［2,3］。

疫苗一直是人们预防和控制PPRS的首选和重要工具，但在当前非洲猪瘟风险增加和养猪形势严峻的情况下，杀毒剂的使用越来越受到人们的关注。金百麦环境改良剂（Genbiom）是一种全新的固态环境改良剂，主要成分为二氧化钛［4］。它不仅可以降解环境中的污染物，还能够起到杀灭病毒和细菌的作用［5］。本试验旨在通过Genbiom对PRRSV杀灭效果的体外试验来验证Genbiom的杀毒能力，以期为PPRS感染的预防和控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PRRSV（分离株，1×104.25TCDI50）为高致病性蓝耳变异株由金百麦生物科技有限公司提供，Marc-145细胞由哈尔滨元亨生物药业有限公司提供，Genbiom干粉由金百麦生物科技有限公司提供，MEM培养基、DMEM培养基，胰酶购自GIBCO公司，新生牛血清购自山西润生大业生物材料有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Marc-145细胞准备将Marc-145细胞以0.5-2×104/孔铺到96孔板内，培养约12h，即长满板底约70%时，将10% FBS DMEM培养基换成含2%FBS和1%双抗的DMEM培养基，用于抗病毒效果评价。

1.2.2 Genbiom最大无毒用量摸索分别无菌称取25mg、50mg、100mg、200mg和400mg已高压灭菌处理的Genbiom于1.5mL离心管中，然后分别加入500µL细胞培养液，震荡混匀，加入1.2.1中准备的Marc-145细胞的细胞板，培养72h，观察细胞病变情况（CPE），无细胞病变的最高量为该产品的最大无毒量。

1.2.3 Genbiom最低有效量测定分别无菌称取25mg、50mg、100mg、200mg和400mg已高压灭菌处理的Genbiom于1.5mL离心管中，然后分别加入100µL PRRSV病毒液（1×104.25TCDI50），震荡混匀，室温下充分作用30min后，加入500µLDMEM培养基，反复震荡混匀，静置5min后，5000rpm，4℃离心5min，取30µL上清接种96孔长满Marc-145单层细胞板，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养72h，观察细胞产生CPE情况，同时分别设病毒阳性和无病毒的空白对照组，不产生CPE的药物最小使用量为该产品的最低有效量。

1.2.4 Genbiom最短作用时间测定无菌称取Genbiom干粉按1.2.2方法测定最低有效量200mg，与PRRSV病毒液（1×104.25TCDI50）进行作用，室温下分别静置5 min、10min、30min、60min，使Genbiom干粉与100µL病毒液充分作用。作用完后，加入500µLDMEM培养基，反复震荡混匀，静置5min后，5000rpm，4℃离心5min，取上清，分别将上清接种长满Marc-145细胞单层的96孔细胞板，同时设阴、阳性对照。将接种后的96孔细胞板置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养72h，记录细胞发生CPE的情况。

3 结果与分析

3.1 Genbiom最大无毒用量摸索

不同用量的Genbiom对Marc-145细胞的毒性作用分析如图1所示。从图1细胞生长状况来看，本研究所选用的5种不同剂量的Genbiom，与阴性对照组相比，Marc-145细胞状态均生长正常，无明显的细胞死亡、圆缩及生长状态不佳情况出现，表明至少用量至400mg的Genbiom对细胞无毒性作用。

3.2 Genbiom最低有效量测定

Genbiom最低有效量检测结果如图2所示。使用25mg Genbiom用量组与病毒作用后，加入Marc-145细胞，培养72h后在倒置显微镜下观察，细胞大量死亡，出现PRRSV的典型病变；50mg用量组，细胞变圆缩、生长状态不佳；100mg用量组，细胞出现少量的圆缩；当200mg和400mg Genbiom与病毒相互作用30min后细胞状态均生长正常，无明显的细胞死亡、圆缩及生长状态不佳情况出现，未见到细胞病变；阴性对照组细胞生长正常，而阳性对照细胞大量死亡，阴阳性对照均成立。根据以上结果可以得出，Genbiom最低有效量为200mg。

图1 不同用量的Genbiom对Marc-145细胞的毒性作用分析

图2 Genbiom最低有效量测定

图3 Genbiom最短作用时间测定结果

3.3 最短作用时间测定结果

Genbiom杀灭PRRSV最短作用时间结果如图3所示。200mg Genbiom与病毒作用15min，加入Marc-145细胞，培养72h，在倒置显微镜下观察，40%细胞出现了死亡、圆缩病变，而Genbiom作用30min、45min和60min，细胞与阴性对照相比，均无细胞病变。本试验的阴阳性对照组均成立，最终确定Genbiom杀灭PRRSV最短作用时间为30min。

4 讨论与结论

兽用消毒剂很多是复方消毒剂，研究人员已经对消毒类产品做过很多研究，对多种病毒、细菌及芽孢菌等杀灭效果也做了大量的对比试验，但目前多数消毒剂为液体消毒，在猪舍内使用容易导致潮湿，尤其在非洲猪瘟影响下的养猪场来说，增加了病毒传播的风险，急需一种可以干粉杀毒，无害无毒，绿色环保的新型消毒剂。

金百麦环境改良剂（Genbiom）采用国际先进的纳米光催化技术，利用二氧化钛（TiO2）半导体的效应，材料表面吸收氧和水分，产生降解环境污染物和抑菌杀菌的作用。例如，Genbiom具有良好的降氨能力［6］，能够维持良好的养殖环境。TiO2在催化过程中具有较强的抑菌作用，可做与食品直接接触的包装材料和食品添加剂［7］。纳米二氧化硅因为其良好的抗菌能力，已经作为医疗植入物在临床中得到应用［8］。

此研究建立了以PRRSV为指示病毒的Genbiom体外杀毒的评价模型，重点评估了Genbiom最低有效量和最短作用时间，以期为PRRS的环境杀灭评估提供一种可行和敏感的方法。可适用于猪场环境及人员、水体消毒和家庭日常消毒等，是一种安全高效环保的环境改良剂。

本研究对Genbiom干粉对PRRSV杀灭效果进行了初步探究，虽然病毒在不同细胞株传代易感性不同［9］，结果可能会有略微差别，但是本次试验结果表明，Genbiom对PRRSV具有良好的杀灭效果，最低有效量为200mg，最短作用时间为30 min，同时根据Genbiom良好的杀毒灭菌能力，可用于猪场消毒及环境改良。