达托霉素高产菌株的选育

杨一恭 孙新强 盛保伟 陈克杰 徐慧丽

摘 要：以达托霉素产生菌--玫瑰孢链霉菌DT-04-11为出发菌株，采用紫外线照射60s，DES诱变处理40min，并结合链霉素耐受性突变株的理性化筛选，选育得到较佳诱变株DT-04-11-19，A21978C效价达到了7073μg/mL，且传代性能稳定，以此突变株为出发菌株，采用50L小罐发酵培养实验表明，28℃培养204h左右，达托霉素效价达2620μg/mL。

关键词：达托霉素;菌种选育

达托霉素是一类新型的抗菌谱广、给药小、药效快以及副作用小的脂肽类抗生素，主要用于治疗革兰氏阳性菌，目前其制剂已在临床上广泛使用，疗效很好。国内外如何提高其产量的研究一直在进行。

目前随着抗生素的广泛使用，病原菌对抗生素的耐药性也越来越强。革兰氏阳性菌感染的病例越来越多，作为治疗严重革兰氏阳性菌感染的万古霉素，其临床应用效果已经下降。因此，开发新型的高效的抗生素意义重大，达托霉素由于有着独特的化学结构和作用机制，并且在临床上表现出抗菌谱广、给药小、药效快以及副作用小[1，2]等诸多特点，备受人们的关注。因此提高达托霉素的生产性能，实现达托霉素产品的市场化，具有重要的科学意义和经济效益。本研究采用紫外线照射和DES诱变处理，并结合链霉素耐受性突变株的理性化筛选，进行达托霉素高产菌株的选育，并对该菌株的发酵工艺条件进行了优化，以获得达托霉素的优良菌株和较理想的发酵工艺，进而为工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）DT-04-11，系浙江医药股份有县公司新昌制药厂保藏菌种。

1.2 培养基及培养条件

斜面及平板培养：采用高氏一号培养基，28℃培养8～9天。

种子培养：750mL三角瓶装75mL培养基，置旋转式摇床28℃，250r/min振荡培养24h。培养基组成为（g/L）：麦芽糊精2.0%，蛋白胨3.0%，葡萄糖2.0%，pH7.5。

摇瓶发酵：250mL三角瓶装30mL培养基，接种量为5%，置旋转式摇床28℃，250r/min振荡培养204h。培养基组成为（g/L）：麦芽糊精15.0%、葡萄糖2.0%、酵母粉3.0%、六水合硫酸亚铁铵0.1%、消泡剂0.02%，初始pH7.5。

1.3 诱变处理

紫外线照射：将单孢子悬液置紫外诱变箱（紫外灯功率30W，波长253.7nm，照射距离30cm）中诱变处理一定时间，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂布平板，28℃，避光培养9天，挑取单菌落转接斜面。

DES诱变：分别取0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲液制备单孢子悬浮液，与DES（用乙醇溶解）混合成一定浓度，置摇床恒温处理40min，经梯度稀释后涂平板，以未经诱变的单孢子悬液做对照，28℃培养9天，挑取单菌落传斜面。

1.4 链霉素耐受性突变株筛选

将经紫外线照射，DES处理或者二者联合处理后得到的孢子悬浮液稀释后，分别涂布于含有一定链霉素浓度的分离平板上，28℃培养9天。

1.5 分析方法

①pH测定：pH电极测定;

②总糖及还原糖含量测定：裴林法;

③氨基氮测定：甲醛法;

④菌丝浓度测定：取10mL待测培养液，放在离心管中，5000rpm，测得沉淀物在发酵液中所占的比例即为菌丝浓度;

⑤达托霉素含量测定：采用高效液相法。固定相：Kromasil C18色谱柱;流动相：55：45（体积比）的含有0.1%三氟乙酸的水：含有0.1%三氟乙酸的乙腈，柱温为30℃，流速1.5mL/min，检测器波长214nm紫外光。

2 结果与讨论

菌种选育：

2.1 UV紫外诱变结果

试验中对出发菌株进行了不同时间的UV诱变处理，待菌落生长成熟后，从每个处理剂量平板中挑取单菌落，各转接斜面，逐一接种发酵瓶，考察诱变剂的发酵水平，并统计其致死率和正突变率。所得结果如表1所示。

由表1可知，当UV照射50S时所得正变率最高，故后续实验中均采用UV照射50S的诱变剂量。

2.2 DES诱变处理结果

硫酸二乙酯（DES）是一种常用的化学诱变剂，其诱变效应受酸碱条件影响。实验中在不同pH条件下以不同剂量DES处理单孢子悬液，处理时间均为40min。当处理时间为40min时，在pH5.5，DES浓度4.0mg/mL和pH8.5，DES浓度3.0mg/mL时所得正变率最高。当pH5.5、DES处理剂量为3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL时，致死率分别为63.1%、82.6%、98.1%，正变率分别为22.3%、46.5%、19.8%;当pH8.5、DES处理剂量为2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL时，致死率分别为56.0%、86.2%、97.6%，正变率分别为20.1%、43.5%、27.9%。

2.3 链霉素耐受筛选

将经过紫外线处理后的原始菌株和未经处理的原始菌株的单孢子悬浮液，按照梯度稀释后均匀涂布于链霉素浓度分别为1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL、2.0μg/mL、2.2μg/mL的平板上，发现随着链霉素浓度增加，平板上的菌落数减少，原始菌株对链霉素的耐受浓度最小为1.8μg/mL。結果如表2。

诱变株经连续5次的传代试验，发酵效价稳定在2000μg/mL以上，说明有比较稳定的性能。

3 讨论

文献报道通过低能离子注入玫瑰孢链霉菌选育高产菌的探究使达托霉素发酵产量达到了1.72 g/L [3，4]本研究以玫瑰孢链霉菌DT-04-11为出发菌株，经紫外线照射和DES诱变处理，并筛选链霉菌耐受菌株，选育得到了高产菌株DT-04-11-19，其效价较出发菌株提高了40%，以高产菌株为实验菌株，进行传代稳定性实验，实验表明传代稳定，表明该菌株是具有良好开发前景的优良菌株。在10L小试罐上实验，发酵产量达到2.6g/L，对达托霉素工业化生产具有很好的借鉴和参考价值。

参考文献：

[1]Debono M， Bernard J， Enzymatic and chemical modifications of lipopeptide antibiotic A21978C： the synthesis and evaluation of daptomycin （LY146032）[J].The journal of antibiotic， 1988（8）：1093-1105.

[2]Quinlan A V， Kinetics of secondary metabolite synthesis in batch culture when two different substrates limit cell growth and metabolite production： xanthan synthesis by Xanthomonas campestris， Annals of the New York Academy of Sciences[J].198，469：259-269.

[3]周剑，刘颖，方东升，等.氮离子注入玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的研究[J].辐射研究与辐射工艺学报， 2008，26（5）：317-320.

[4]周剑，黄建峰，张引，等.低能离子注入诱变达托霉素高产菌株及其发酵的研究[J].中国抗生素杂志，2012，37（8）： 587-592.