106份水稻材料稻瘟病抗性鉴定及Pi9基因的分子检测

2020-04-29陈晴晴夏加发张海珊张爱芳

安徽农业科学 2020年7期

陈晴晴夏加发张海珊张爱芳

摘要采用苗期喷雾接种鉴定方法并利用Pi9基因的特异性分子标记检测，分析106份水稻材料的稻瘟病抗性水平及Pi9基因的分布情况。结果表明，106份水稻材料对供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分别为94.3%、92.4%、92.4%、87.7%、59.4%、62.3%;27份水稻材料（占25.5%）含有Pi9基因，其对供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分别为100%、100%、100%、96.3%、88.9%、92.6%。可见，Pi9基因在安徽省水稻抗病育种中具有一定应用价值。

关键词稻瘟病;Pi9基因;抗性鉴定;分子检测

中图分类号 S435.111.4+1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0154-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.043

Evaluation and Distribution of the Blast Resistance Gene Pi9 of 106 Rice Materials

CHEN Qingqing1， XIA Jiafa2， ZHANG Haishan1 et al

（1.Institute of Plant Protection and Agricultural Product Quality and Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei，Anhui 230031;2.Rice Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei，Anhui 230031）

Abstract 106 rice materials were assessed for blast resistance and resistance gene Pi9 distribution by using specific molecular markers. The results showed that the resistance rates of 106 rice materials to the tested strains ZB1， ZB2， ZB3， ZA0， ZA1 and ZA2 were 94.3%， 92.4%， 92.4%， 87.7%， 59.4% and 62.3%. 27 materials （25.5%） contained the resistance gene Pi9 and the resistance rate to the tested strains ZB1， ZB2， ZB3， ZA0， ZA1 and ZA2 were 100%， 100%， 100%， 96.3%， 88.9% and 92.6%. It can be seen that the resistance gene Pi9 has certain application value in rice breeding for disease resistance in Anhui Province.

Key words Rice blast;Pi9 gene;Resistance identification;Molecular detection

基金項目安徽省科技重大专项（18030701175）。

作者简介陈晴晴（1987—），女，安徽蚌埠人，研究实习员，从事水稻病害抗性鉴定与评价研究。通信作者，副研究员，从事水稻病害抗性鉴定与评价研究。

收稿日期 2019-12-10;修回日期 2020-01-10

稻瘟病是由稻梨孢属真菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr，无性态为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]引起的水稻三大病害之一，在全球水稻种植区均有发生，导致每年水稻产量损失10%～15%，损失达数十亿美元，严重危害水稻生产[1-3]。稻瘟病也是我国南北稻区危害最严重的病害之一，每年都有几个稻作区中等或偏重流行，且有增长趋势，因此如何防治和减少病害发生，对水稻生产具有重要意义[4-5]。

实践证明，选育和种植抗病水稻品种是防治稻瘟病最经济有效的途径，而发掘和利用水稻抗性遗传资源是水稻抗稻瘟病育种的基础[6]。近年来发展起来的分子标记技术可快速、准确鉴定出材料中所含的抗性基因类型，并利用与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，这对于培育抗稻瘟病水稻品种有重要意义[7]。

Pi9基因源自小粒野生稻，位于水稻6号染色体，是NBS-LRR类基因，是已克隆的抗稻瘟病主效基因之一，抗性比较广，对来自13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出很高的抗性[8-10]。邹德堂等[11]研究表明Pi9基因在黑龙江省水稻抗病育种中具有很高应用价值，在黑龙江省乃至全国范围内加强对Pi9基因推广和应用意义重大。

笔者采用苗期喷雾接种鉴定方法对106份水稻材料进行稻瘟病抗性鉴定，并利用特异性分子标记检测方法对其Pi9基因的分布情况进行分析，以期明确Pi9基因在提高水稻抗病性方面的价值，为安徽省抗稻瘟病品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 水稻材料。106份供试水稻材料由安徽省农业科学院水稻研究所提供。单18（含Pi9基因）系作为阳性对照;丽江新团黑谷作为阴性对照。

1.1.2 供试菌株。供试菌株是笔者所在课题组在安徽省内采集并分离鉴定的6个菌株（ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2）。

1.2 试验方法

1.2.1 稻瘟病抗性鉴定。将供试菌株转接于PSA（马铃薯蔗糖琼脂粉）培养基上，在25～27 ℃培养箱中培养5～7 d，待菌丝长满培养皿后，将长满菌丝的培养基切块移植到大麦粒培养基中，待稻瘟病菌产生大量孢子后，用无菌水清洗、过滤至烧杯中，配制孢子悬浮液（10×10倍光学显微镜每视野15～20个孢子）[12]。

供试材料经过浸种、催芽后，播种在育秧盘中，每份材料10～15粒。待秧苗3～4叶期时，用供试菌株孢子液喷雾接种。接种后置于25～28 ℃温室内，并定时喷雾保湿。接种7 d后，参照国际统一标准调查发病情况：0级为高抗（HR），1～2级为抗（R），3级为中抗（MR），4～5级为中感（MS），6～7级为感（S），8～9级为高感（HS）[13-14]。

1.2.2 水稻DNA提取及PCR检测。使用新型植物基因组DNA提取试剂盒（DP320-02）提取水稻叶片基因组DNA，并保存于-20 ℃备用。选用与Pi9基因紧密连锁的引物进行PCR扩增反应。引物序列由笔者所在课题组前人提供，Pi9-1F/R（5′—3′）：TGCCCAACCTTTACCCACTGTA/ AACATGAGTAGAAACAAATTAGTTTG，并由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系总体积20 μL，包括10 μL 2×SanTaq PCR Mix（含蓝染料），2 μL模板DNA，正、反向引物各1 μL，6 μL ddH2O。PCR反應程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。8 μL扩增产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统中拍照[15-16]。

1.3 数据分析

根据水稻材料抗性水平调查结果计算其抗病率，抗病率=（高抗+抗+中抗）/总数×100%[17]。依据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，判断供试水稻材料中Pi9基因的有无。

2 结果与分析

2.1 水稻材料对稻瘟病的抗性表现

利用采自安徽的6个稻瘟病菌株分别接种供试水稻材料，结果见表1。由表1可知，106份水稻材料分别接种供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2后，判断抗病材料分别有100份（94.3%）、98份（92.4%）、98份（92.4%）、93份（87.7%）、63份（59.4%）、66份（62.3%）。可知，供试水稻材料对安徽省稻瘟病菌ZB群的抗性表现较好。

根据抗性水平调查结果，106份水稻材料对所有供试菌株均表现抗病（0～3级）的材料有53份，占比50%。由此筛选出抗病材料，为安徽省水稻抗病育种提供材料。

2.2 Pi9基因的分子检测结果

利用Pi9基因的特异性分子标记对供试水稻材料进行检测，27份供试材料与单18（阳性对照）一样能在750～1 000 bp处扩增出1条特异条带，表明它们均含有Pi9基因;其余供试材料与丽江新团黑谷（阴性对照）一样，没有扩增出条带，表明不含Pi9基因（图1）。含有Pi9基因的材料占供试水稻材料的25.5%，说明Pi9基因在供试水稻材料中占比不高。

2.3 含Pi9基因的水稻材料对稻瘟病的抗性表现

由表2可知，27份含有Pi9基因的水稻材料对供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3的抗性水平全部达到中抗及以上（抗病率为100%），对ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分别为96.3%、88.9%、92.6%。可知，含有Pi9基因的水稻材料抗病率明显较高。

3 结论与讨论

稻瘟病是水稻生产中最主要，也是最严重的病害之一，发病严重且易反复[18]。安徽省水稻生态环境多样，气候条件复杂，特别是江淮丘陵和皖西南山区，稻瘟病常年有不同程度发生，有的年份暴发成灾，损失严重。区试参试品种对稻瘟病的抗性表现整体不高[12]。另外，由于稻瘟病菌生理小种存在遗传复杂性、致病性多样性，生产中推广的种植品种3～5年就会丧失抗性。因此，挖掘抗性水平高的种质资源，对于提高稻瘟病抗性具有重要意义[19]。近年来，育种和植保工作者协同攻关，不断发掘稻瘟病抗源。阎勇等[20]从52份华南常用籼稻亲本中筛选获得广谱抗性材料4份，其中2份抗谱为100%，可利用这些抗源拓宽育种材料的遗传背景。该研究从106份水稻材料中获得53份抗病材料，其对所有供试菌株均表现中抗及以上，表明安徽省育种工作者可以对其利用研究。

目前，利用分子标记技术对水稻材料进行抗性基因检测，可以提高抗病基因鉴定及育种选择的效率[21-22]。Pi9基因是已报道的稻瘟病抗性主效基因之一，研究表明，Pi9基因对我国主要稻区稻瘟病病菌具有较好的抗性，在抗病育种中有很大利用价值[23-26]。该研究分析Pi9基因在水稻材料中的分布情况，筛选出27份含有Pi9基因的水稻材料，为今后育种工作中优良品种选育提供理论依据。结合抗病性鉴定结果，Pi9基因在安徽省抗病育种中具有较高的应用价值。

另外，考虑多个抗病基因综合应用，利用多个优良基因拓宽抗谱，是提高水稻品种抗性、减缓品种抗性丧失和培育具有持久抗性品种的途径[27-29]。该研究所获得的抗病材料中可能含有其他抗性基因，有待进一步发掘和利用。

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