基于网络药理学的安肠愈疡汤治疗溃疡性结肠炎作用机制研究

樊静娜

摘要：目的  基于网络药理学探讨安肠愈疡汤治疗溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的作用机制。方法  通过中医药整合药理学研究平台构建安肠愈疡汤的潜在靶标与UC疾病靶标之间的相互作用网络。基于GO数据库和KEGG通路数据库进行基因功能和通路富集，采用Cytoscape3.6.1软件构建靶标-信号通路网络、药物活性成分-靶标网络，采用荧光实时定量PCR对网络药理学主要分析结果进行验证。结果  分析结果表明，安肠愈疡汤靶点主要关联UC炎症因子及免疫调控，糖类、脂质和氨基酸代谢，能量代谢，神经-内分泌系统调节等;体外实验提示，安肠愈疡汤参与调控GCK、CROT介导的糖脂代谢，GNB1介导的炎症通路，以及ATP1A1、COX7C介导的能量代谢、氧化磷酸化、线粒体电子呼吸链传递等通路。结论  安肠愈疡汤治疗UC具有多成分、多靶点的特点，可为进一步研究其作用機制提供依据。

关键词：安肠愈疡汤;溃疡性结肠炎;网络药理学;作用机制

中图分类号：R259.746.2;R2-05    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）01-0092-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201902170

Study on Mechanism of AnchangYuyang Decoction in Treating Ulcerative ColitisBased on Network Pharmacology

FAN Jingna

First Clinical Medical School， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China

Abstract： Objective To explore the mechanism of Anchang Yuyang Decoction in the treatment of ulcerative colitis （UC） based on network pharmacology. Methods The interaction network between UC targets and potential targets of Anchang Yuyang Decoction was constructed through Integrative Pharmacology-based Research Platform of TCM. Gene function and pathway enrichment were conducted based on GO database and KEGG pathway database. Cytoscape3.6.1 was used to construct target-signal pathway network and pharmaceutically active component-target network. The main results of network pharmacology were verified by real-time quantitative PCR. Results The results showed that the targets of Anchang Yuyang Decoction were mainly associated with inflammatory chemokines and immune system regulation in UC， carbohydrates， lipids and amino acid metabolism， energy metabolism， neuro-endocrine system regulation， etc. Vitro experiments indicated that Anchang Yuyang Decoction was involved in the regulation of glucose and lipid metabolism mediated by GCK and CROT， inflammatory pathway mediated by GNB1， as well as energy metabolism， oxidative phosphorylation， mitochondrial electron respiratory chain transmission mediated by ATP1A1 and COX7C. Conclusion AnchangYuyang Decoction applied for treating UC has the advantages of multi-components and targets， which can provide references for further research on mechanism.

Keywords： Anchang Yuyang Decoction; ulcerative colitis; network pharmacology; mechanism

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以结肠和直肠黏膜弥漫性炎症为特征的慢性非特异性炎症性肠病。本病临床症状以发作、缓解交替出现为特点，易复发，且部分重症患者病情重、变化快，药物治疗效果不佳。目前，现代医学对UC病因及发病机制未完全阐明，尚无针对其病因的特效药物。中医通过辨病与辨证相结合，抓住UC病机特点，随证加减用药，可显著改善UC患者生活质量，维持疾病临床缓解，防治并发症，并降低疾病复发率^[1]。

安肠愈疡汤是导师迟莉丽教授经多年临床实践总结的经验方，药用黄芪、薏苡仁、白术、黄芩、黄连、木香、槟榔、地榆、当归、防风、白芍、白及、甘草，共奏扶正补虚、解毒安肠之功。临床和实验研究表明，安肠愈疡汤能显著改善UC患者临床症状，减少病情复发，具有较好的抗炎和促进溃疡修复的作用^[2-5]。因此，深入探讨安肠愈疡汤的作用靶点，分析其可能的作用机制，对于阐述安肠愈疡汤的科学内涵具有重要作用。

中药复方成分复杂，生物体生命活动规律的复杂性也限制了中药现代研究的模式和方法。整合药理学平台在活性成分发现、作用分子机制阐释、中药质量标志物确认等方面有良好的应用前景，可通过整合中药化学成分、疾病靶标构建“化学成分-作用靶标-疾病靶标-蛋白质相互作用网络”^[6]，可从分子层面较好阐释中药方剂的作用机制。因此，本研究借助整合药理学平台，探讨安肠愈疡汤治疗UC的可能作用机制，以期为安肠愈疡汤的深入研究提供依据。

1  资料与方法

1.1  复方中药成分及靶标检索

中医药整合药理学研究平台（http：//www.tcmip.cn/）中药材数据库依据2015年版《中华人民共和国药典》，收录400余味常用中药材。通过该平台逐一录入安肠愈疡汤各单味药名称，收集药物所有化学成分，建立安肠愈疡汤的化学成分数据库，包括化合物编号、中英文名称、分子式等。

1.2  候选疾病靶标来源

在中医药整合药理学研究平台疾病/症状靶标数据库中，以“colitis”“ulcerative”“IBD”作为疾病关键词进行搜索，选取检索出的药物靶标基因、靶标蛋白等相关信息作为药物候选靶标来源。

1.3  靶标预测

通过OpenBabel软件并应用MACCS（molecular access system）分子指纹技术提取药物化学成分，对安肠愈疡汤中化学成分二维结构（.mol）与Drug Bank数据库（https：//www.drugbank.ca/）中的药物进行化学指纹特征比对，以Tanimoto系数定义的相似度计量方法进行相似性打分，取分数>0.8的药物靶标为安肠愈疡汤作用的潜在靶标。

1.4  蛋白质-蛋白质相互作用信息

中医药整合药理学研究平台镶嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、In Act、HPRD、PDZBase、MINT、DIP等数据库中蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据。通过该平台的PPI数据库，可直接获得安肠愈疡汤作用的潜在靶标与UC疾病靶标之间的PPI信息。

1.5  网络构建与分析

通过中医药整合药理学研究平台，针对安肠愈疡汤作用的潜在靶标与UC疾病靶标之间的相互作用网络，以节点连接度的2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病基因相互作用网络的核心節点，同时选取满足节点连接度（degree）、节点紧密度（closeness）和节点介度（betweenness）中位数的节点，构建安肠愈疡汤的潜在靶标与UC疾病靶标之间相互作用的关键靶标网络。

1.6  基因功能和通路富集分析

中医药整合药理学研究平台基于GO数据库（Gene Ontology，http：//www.geneontology.org/）和KEGG通路数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）资源，确定靶标基因、蛋白质分子功能、细胞内定位，及其所参与的生物学反应和通路，结合富集计算，得出安肠愈疡汤的直接作用靶标和UC疾病的核心靶标，进行基因功能分析和通路分析，并将所得结果按P值降序排列，选取P值前20位的通路，构建“中药方剂-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路”的多层次关联网络。借助Cytoscape3.6.1（http：//www.cytoscape.org）软件构建疾病靶标-信号通路网络、药物活性成分-疾病靶标网络。

1.7  体外验证实验

1.7.1  细胞与试药

人结直肠腺癌HT-29细胞，中乔新舟有限公司。DMEM培养基（货号10-013-CVR），CORNING公司;胎牛血清（FBS），LONSERA公司;青霉素-链霉素（P/S），HyClone公司;脂多糖（LPS），Sigma公司;TB Green Premix Ex Taq PCR试剂盒，TAKARA公司。安肠愈疡汤，购自山东中医药大学附属医院，取1剂，经水提、蒸发、浓缩至不流动的清膏，使用时称取适量，溶解，过0.22 μm滤膜除菌后于-20 ℃保存。

1.7.2  细胞培养及分组干预

HT-29细胞培养于DMEM培养基（含10%FBS、1%P/S），37 ℃、5%CO₂培养箱培养，细胞贴壁后取对数生长期细胞，分为3组。对照组：加入不含FBS、P/S的DMEM中孵育24 h;模型组：予LPS（20 μg/mL）孵育24 h^[7];实验组：根据预实验结果，在模型组干预基础上予安肠愈疡汤1 mg/mL孵育24 h。

1.7.3  检测指标及方法

Trizol法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，根据试剂盒说明书进行荧光实时定量PCR检测。预变性引物见表1。

1.7.4  统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  药物化学成分靶标预测及分析

通过中医药整合药理学研究平台收集安肠愈疡汤13味中药共591种化学成分，通过与Drug Bank数据库中的药物进行比对，相似性分数≥0.8的靶标共3405个。各单味药两两之间的共有靶标，除甘草外，黄芪、黄芩、槟榔、当归、木香、白术、白芍、防风与其他药味间的共有靶标均大于100个。

对安肠愈疡汤候选靶标进行基因分析，取P值排名前20位，得到候选靶标的基因功能，涉及离子性谷氨酸受体信号通路、线粒体基质、蛋白质翻译的tRNA氨酰化、线粒体内膜、氧化还原过程、氨基酸跨膜转运活动、鸟氨酸循环、细胞色素C氧化酶活性、线粒体电子传递等。对安肠愈疡汤候选靶标进行通路富集分析，取P值排名前20位，得到候选靶标参与的通路信息，主要涉及谷氨酸能突触、氨基酸代谢、氨酰化tRNA的合成、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸、谷氨酸代谢、辅酶因子和维生素的代谢、能量代谢等通路。

2.2  基因功能和通路富集分析

通过GO数据库分析，安肠愈疡汤药物靶标与UC疾病靶标基因功能有信号转导、G蛋白偶联受体信号通路、炎症反应、老化、化学突触传递、腺苷酸环素-G蛋白偶联受体信号通路、激活蛋白激酶A活性、胞质钙离子浓度的调节、MAPK级联反应、环磷酸腺苷的合成、缺氧反应、离子性谷氨酸受体信号通路、转化生长因子受体信号通路、线粒体ATP合成质子传输等条目，见表2。

通过KEGG数据库富集安肠愈疡汤治疗UC关键靶标所参与的通路主要涉及趋化因子信号通路、嘌呤代谢、核苷酸代谢、神经系统、核糖体、内分泌系统、谷氨酸能突触、胆碱能突触、ErbB信号通路等，见表3。

2.3  中药成分-靶标-通路多维网络分析

基于PPI数据库，构建安肠愈疡汤潜在药物靶标与疾病靶标相互作用网络。根据条件筛选出关键靶标184个（见图1），图中节点大小与degree值成正比，其中疾病靶标主要有CCR9（趋化因子受体9）、IKBKB（IKKβ，NF-κB激酶亚单位β抑制剂）、HPRT1（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）等，药物靶标主要有CROT（肉毒碱酰基转移酶）、GCK（葡萄糖激酶）、ATP1A1和ATP5C1（钠/钾转运ATP酶）、COX7C和COX5B（细胞色素C氧化酶）、EPRS（双功能氨酰-tRNA合成酶），这些药物靶标主要涉及能量代谢、单核细胞和巨噬细胞的调控、脂肪酸及糖类代谢等。疾病靶标-信号通路网络见图2，疾病靶标-药物活性成分网络见图3。大部分靶标及富集通路主要涉及能量代谢、炎症趋化因子及免疫系统的调控、糖类、脂肪酸及氨基酸的代谢等。筛选核心节点前10位的疾病靶标，构建疾病靶标与活性化合物的网络，其中共有活性化合物136种，安肠愈疡汤中与疾病靶标关系密切的药物主要为黄芪、黄芩、地榆、甘草、槟榔，药物及其所含活性化合物数量依次为：黄芩（32）、地榆（31）、甘草（28）、黄芪（19）、槟榔（12）、白芍（7）、当归（3）、防风（3）、白术（2）、木香（2）、黄连（1），其中黄芪皂苷、三萜类的鞣质、地榆皂苷、甘草皂苷、黄酮类物质、黄芩素、氨基酸等在活性成分中占主要比例。

2.4  安肠愈疡汤对LPS诱导的HT-29细胞GCK、CROT、ATP1A1、GNB1、ATP5C1、COX7C mRNA的影响

LPS作用24 h，GCK、CROT、GNB1表达下调，ATP1A1、COX7C表达上调（P<0.05），表明LPS可诱导活化各基因;安肠愈疡汤干預后，GCK、CROT、ATP1A1、GNB1 mRNA表达升高（P<0.05），COX7C mRNA表达受到抑制（P<0.05）。ATP5C1 mRNA表达未见明显变化。见表4。

3  讨论

UC属中医学“休息痢”“肠澼”“肠风”范畴，多因感受外邪，饮食不节，损伤脾运，或素体禀赋不足，情志内伤，脾虚运化失职，湿浊内生，积聚日久化为湿热浊毒，蕴结肠腑，气血凝滞，损伤肠膜脂络而致。迟莉丽教授认为，虚、毒、瘀是UC的基本病机，以脾胃虚损为本，毒损肠络、肠络瘀阻为标，据此拟方安肠愈疡汤，健脾益气以扶正，祛湿解毒以祛邪，标本兼顾，共奏扶正补虚、解毒安肠之功，适用于UC脾虚毒恋证。实验研究表明，安肠愈疡汤可通过调控肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（IL）-8等炎症因子释放及抑制核因子-κB通路等，减弱炎症级联反应并促进三叶因子3、黏蛋白2等促进黏膜修复^[8-9]。临床研究显示，安肠愈疡汤能显著改善UC患者临床症状，减少病情复发，具有较好的抗炎和促进溃疡修复的作用^[2-5]。

本研究通过中医药整合药理学研究平台收集安肠愈疡汤中13味中药化学成分和靶标，结果显示，每味中药可作用于多个靶标，多种中药可同时作用于一个靶点，说明药物间发挥作用有着密切的关系，各药相须相使相辅相成。对基因功能和通路富集的分析显示，安肠愈疡汤对UC的干预作用主要涉及炎症因子趋化，氨基酸、脂质代谢，神经-内分泌系统的调节，能量代谢等。通过构建安肠愈疡汤潜在药物靶标与疾病靶标相互作用网络，筛选出关键靶标184个，其中疾病靶标主要有CCR9、IKBKB、HPRT1，药物靶标主要有CROT、GCK、ATP1A1、ATP5C1、COX7C、COX5B、EPRS。通过构建疾病靶标-信号通路网络，发现大部分靶标及富集通路主要涉及能量代谢、炎症趋化因子及免疫系统的调控、糖类、脂肪酸及氨基酸的代谢等。UC在氨基酸代谢、脂类代谢、糖代谢等生理过程可能存在一定的紊乱。王敦方等^[10]利用超高液相色谱-质谱技术观察黄芩汤对UC大鼠血清代谢谱的变化，发现UC模型大鼠能量代谢涉及的乳酸、肌酸，胆碱代谢产物如三甲胺，脂类代谢产物如棕榈酸等均出现异常，应用黄芩汤干预后有趋向于正常水平的趋势，尤其是缬氨酸、色氨酸、乳酸、尿素等物质代谢最为突出。本研究预测结果与文献报道相符，提示应重视氨基酸代谢、脂类代谢、糖代谢在UC中的重要作用。筛选核心节点前10位的疾病靶标，构建疾病靶标与活性化合物的网络，共有136种活性成分，安肠愈疡汤中与疾病靶标关系密切的药物主要为黄芪、黄芩、地榆、甘草、槟榔，其中黄芪皂苷、三萜类的鞣质、地榆皂苷、甘草皂苷、黄酮类物质、黄芩素、氨基酸等活性成分占主要比例。研究表明，黄芪多糖可调节UC大鼠血清炎症因子IL-4、IL-5、IL-13含量，调节IL-27和干扰素-γ，抑制Th17细胞分化，调节免疫平衡^[11-12]。甘草酸二胺具有与皮质类固醇类似的非特异抗炎作用，原皓等^[13]研究认为可能是通过上调外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA的表达，抑制自身反应性淋巴细胞增殖，从而减轻炎症反应。黄芩苷可通过调节p-STAT4/STAT4、p-STAT6/STAT6及相关细胞因子调节免疫平衡，缓解UC炎症反应^[14]。

采用安肠愈疡汤干预脂多糖诱导的HT-29细胞炎症模型验证网络药理学研究结果，发现安肠愈疡汤可显著上调GCK、CROT、ATP1A1、GNB1表达。GCK上调可提高细胞内糖类代谢水平，提高糖酵解效率。ATP1A1水平升高可提高细胞内能量代谢，增加细胞供能。CROT是细胞内脂质代谢中产生脂肪酰辅酶A重要的催化酶^[15-16]，其上调表明细胞内脂肪酸氧化代谢增强，与预测安肠愈疡汤参与调控糖类、脂肪酸代谢相吻合。GNB1参与炎症趋化因子调节通路，是JAK/STAT、MAPK等信号通路的重要启动蛋白，研究发现GNB1介导Akt信号转导并促进核因子-κB的活化^[17]。COX7C在新陈代谢、氧化磷酸化、线粒体电子呼吸链的传递中发挥重要作用，可能与GCK、ATP1A1共同参与细胞内的能量代谢调节过程。体外验证实验在一定程度上证实了网络药理学预测结果。

本研究基于网络药理学技术，采用整合药理学平台，建立了安肠愈疡汤成分靶标-溃疡性结肠炎靶标的分子生物网络、复方中药-成分-靶标-通路网络，从多个角度探索安肠愈疡汤治疗UC的潜在分子机制。结果表明，安肠愈疡汤可通过调控能量代谢，炎症趋化因子及免疫系统，糖类、脂肪酸及氨基酸的代谢等多靶点、多途径发挥治疗UC的作用，其具体机制及物质基础还需通过更深入的实验研究加以验证。

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（收稿日期：2019-02-21）

（修回日期：2019-03-23;编辑：陈静）