基于NALP3炎性体的痛风宁对急性痛风性关节炎大鼠抗炎作用量效和时效研究

王建辉　李保林　蔡唐彦　郭洁梅　朱亚菊　滕方舟　张艺强　肖艳　毛骁　苏友新

摘要：目的  觀察痛风宁对急性痛风性关节炎（AGA）大鼠NALP3炎性体及相关炎症因子的影响，探讨其抗炎作用的量效与时效关系。方法  将240只SD大鼠随机分为造模组200只和正常组40只。右后踝关节腔内注射尿酸盐混悬液制作大鼠AGA模型，成模大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组及痛风宁低、中、高剂量组，每组40只。正常组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃，其余组大鼠给予相应药物灌胃干预。首次干预后6、12、24、48 h各组随机取10只大鼠处死，收集右后踝关节液与滑膜组织，采用ELISA、Western blot和RT-qPCR分别检测白细胞介素-1β（IL-1β）、前列腺素E₂（PGE₂）含量及NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达。结果  与正常组比较，模型组大鼠各时间点IL-1β、PGE₂含量及NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达明显升高（P<0.01）;与模型组比较，痛风宁中、高剂量组及秋水仙碱组大鼠各时间点IL-1β、PGE₂含量及NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达均明显降低（P<0.01，P<0.05）;与秋水仙碱组比较，痛风宁中、高剂量组大鼠各时间点IL-1β、PGE₂含量及NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达无明显差异（P>0.05），痛风宁低剂量组大鼠明显升高（P<0.01，P<0.05）。结论  中剂量痛风宁在下调模型大鼠NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达及降低IL-1β、PGE₂含量方面作用相对较佳，且首次干预后48 h抗炎作用相对明显。

关键词：痛风宁;NALP3炎性体;急性痛风性关节炎;量效;时效;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）01-0051-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906101

Study on Tongfengning on Dosage Effect and Time Effect of Anti-inflammatory in Model Rats with Acute Gouty Arthritis Based on NALP3 Inflammasome

WANG Jianhui¹， LI Baolin¹， CAI Tangyan²， GUO Jiemei^1，2， ZHU Yaju¹， TENG Fangzhou¹，ZHANG Yiqiang¹， XIAO Yan¹， MAO Xiao¹， SU Youxin^1，2

1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;

2. Fuijiang Health College， Fuzhou 350101， China

Abstract： Objective To observe the effects of Tongfengning on NALP3 inflammasome and related inflammatory factors in acute gouty arthritis （AGA） rats; To explore the dosage effect and time effect of its anti-inflammatory effect. Methods Totally 240 SD rats were randomly divided into model rats （n=200） and normal rats （the normal group， n=40）. The AGA model was made by intraperitoneal injection of urate suspension into the right posterior ankle joint of the rats. Model rats were randomly divided into model group， colchicine group and Tongfengning low-， medium- and high-dosage groups， with 40 rats in each group. Normal group and model group were given the same amount of normal saline for gavage， and other groups were given the corresponding medicine for gavage intervention. At 6 h， 12 h， 24 h， and 48 h after the first intervention， 10 rats in each group were sacrificed at each time point， and the right posterior ankle joint fluid and synovial tissue were collected. ELISA， Western blot， and RT-qPCR were used to detect the contents of interleukin-1β （IL-1β） and prostaglandin E₂ （PGE₂）， and expressions of NALP3， ASC， Caspase-1 protein and mRNA. Results Compared with the normal group， the contents of IL-1β and PGE₂， and the expressions of NALP3， ASC， Caspase-1 protein and mRNA increased in the model group at each time point （P<0.01）; Compared

with the model group， the contents of IL-1β and PGE₂， and the expressions of NALP3， ASC， Caspase-1 protein and mRNA significantly decreased in Tongfengning medium- and high-dosage groups at each time point （P<0.01， P<0.01）; Compared with the colchicine group， the contents of IL-1β and PGE₂， and the expressions of NALP3， ASC， Caspase-1 protein and mRNA were not significantly different in the Tongfengning medium- and high-dosage groups at each time point （P>0.05）， while they increased significantly in Tongfengning  low-dosage group （P<0.01， P<0.05）. Conclusion The medium dosage of Tongfengning is relatively better in down-regulating the expressions of NALP3， ASC， Caspase-1 protein and mRNA and decreasing the contents of IL-1β and PGE₂， and its anti-inflammatory effects were relatively obvious 48 h after the first intervention.

Key words： Tongfengning; NALP3 inflammasome; acute gouty arthritis; dosage effect; time effect; rats

痛风是由于尿酸生成增多和/或尿酸排泄减少导致尿酸盐（MSU）沉积所致的晶体相关性关节病^[1]。临床所见痛风多为急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）的状态，发病急骤，多于深夜发作，受累关节及周围组织红、肿、热、痛和功能受限均明显，尤其是疼痛呈撕裂样、刀割样或咬噬样，且进行性加剧^[2]，严重影响患者身心健康。痛风宁是本课题组在痛风“内湿致痹”发病观^[3]指导下组方并经临床使用多年的效验方，该方能明显降低关节液中炎症因子含量，减轻AGA动物模型关节炎症反应^[4-7]。前期研究发现，痛风宁可能通过下调核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NALP3）炎性体中NALP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和Caspase-1的表达，进而抑制下游炎症因子的生成以减轻AGA炎症反应^[8]，但其抗炎作用的量效与时效尚未完全阐明。本研究通过观察不同剂量痛风宁干预AGA大鼠模型不同时间点NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达，以及下游炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）、前列腺素E₂（PGE₂）含量的变化，进一步探讨痛风宁抗炎作用的量效与时效关系，为该方临床应用提供依据。

1  实验材料

1.1  动物

3月龄健康雄性SD大鼠240只，SPF级，体质量（200±20）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物房，温度（22±2）℃，相对湿度60%±10%，12 h/12 h明暗周期，自由摄食饮水。

1.2  药物及制备

痛风宁（土茯苓∶萆薢∶丹参∶川牛膝∶秦艽∶肿节风∶泽泻∶金钱草∶苍术∶黄柏=10∶5∶5∶4∶3∶5∶5∶7∶3∶2），饮片购自福建中医药大学附属国医堂医院，药物经煎煮、过滤、浓缩成含原药材1 g/mL痛风宁药液，置于4 ℃冰箱保存备用。秋水仙碱片，西双版纳药业有限责任公司，0.5 mg/片，批号170302，用蒸馏水配制成0.04 mg/mL秋水仙碱混悬液，备用。

1.3  主要试剂与仪器

MSU晶体（美国Sigma公司，批号BCBV0453），以无菌生理盐水为溶剂，MSU晶体与聚山梨酯-80（吐温80）以1500 mg∶6 mL配成25 mg/mL MSU混悬液，灭菌后4 ℃备用;大鼠IL-1β、PGE₂ ELISA试剂盒（上海西唐科技有限公司，批号1710262、1710251），兔抗大鼠NALP3单克隆抗体（武汉博士德，批号84111P141），小鼠抗大鼠ASC单克隆抗体、兔抗大鼠Caspase-1单克隆抗体（上海圣克鲁斯，SC-514414、22915-1-AP），β-actin小鼠单克隆抗体、HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG（美国Proteintech公司，批号66009-1-IG、SA00001-2、SA00001-1），BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、Trizol（北京碧云天，批号040617170707、2017072402），超敏ECL化学发光试剂盒（美国Thermo公司，批号101316170228），ChamQ SYBR qPCR Master Mix、RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent（南京Vezyme公司，L/N7E160F7、R12301）。RH-B-1-S25型磁力攪拌器（德国IKA公司），ELX800型全自动酶标仪（美国Bio-Tek公司），PowerPac^TM型电泳仪、Yrdimes S-D Blotter型半干转印系统、ChemiDocXRS化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司），ABI 7500型Real-Time PCR仪（美国ABI公司），PE 9600型PCR扩增仪。

2  实验方法

2.1  分组、造模和给药

实验大鼠适应性喂养7 d，采用随机数字表法分为造模组200只和正常组40只。造模组参照Coderre等^[9]方法造模，向大鼠右后踝关节腔内注射25 mg/mL MSU混悬液0.2 mL。于造模后4 h进行模型鉴定^[10]，成模大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组和痛风宁低、中、高剂量组，每组40只。正常组大鼠注射等量生理盐水。参照人与大鼠体表面积换算法^[11]，按成人每日服用痛风宁剂量为中剂量，得痛风宁低、中、高剂量组大鼠每日给药量分别为7.65、15.3、30.6 mL/kg，按成人秋水仙碱每日最大治疗药量6 mg，得秋水仙碱组每日大鼠给药量为0.6 mg/kg，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日2次，连续2 d。

2.2  一般观察

观察大鼠精神、饮食、行为、毛发、大便等。

2.3  标本采集

首次干预后6、12、24、48 h，各组随机选取10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，备皮，消毒。于冰上切开大鼠右后肢踝关节囊，生理盐水冲洗，收集关节冲洗液于无菌EP管，离心，取上清液，-20 ℃冰箱保存。再取踝关节滑膜组织，置于无酶EP管，-80 ℃冰箱保存。取材完毕后，脱颈处死。

2.4  白细胞介素-1β、前列腺素E₂含量检测

按ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定450 nm波长处各反应孔OD值，计算关节液中IL-1β、PGE₂含量。

2.5  NALP3、ASC、Caspase-1蛋白表达检测

液氮中充分研磨滑膜组织，称重，装入EP管，按1 mg∶5 μL比例加入裂解液，冰上震荡匀浆后，离心，取上清液。按BCA法操作测定总蛋白浓度。配好分离胶与浓缩胶，蛋白上样按每孔30 μg计算上样量，Marker上样量为3 μL，上样完成后进行凝胶电泳（20 V、10 min，60 V、20 min，100 V、80 min）。切取目的蛋白条带，转膜至PVDF膜。随后将PVDF膜置于TBST中漂洗5 min，再置于封闭液中室温封闭2 h;一抗4 ℃摇床孵育过夜（一抗稀释比例：NALP3 1∶200;ASC 1∶200;Caspase-1 1∶5000;β-actin 1∶5000），TBST漂洗3次×10 min;二抗室温孵育1 h，TBST 漂洗3次×10 min。PVDF膜进行化学发光显影，并应用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相应表达量。

2.6  NALP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达检测

液氮中充分研磨滑膜组织，按Trizol法提取组织总RNA。分光光度计测定样品OD_{260 nm}/OD_{280 nm}值，计算每管RNA浓度。按试剂盒说明书进行反转录-聚合酶链反应合成cDNA，依次加入相应体积RNA溶液（按3 μg上样量计算），再用ddH₂O定容至18 μL，然后加入4×gDNA 6 μL至24 μL，混匀后离心，置于PCR仪（42 ℃、2 min），再加5×qRt Super Mix Ⅱ 6 μL至30 μL，荡匀后离心，置于PCR仪（50 ℃、15 min，85 ℃、2 min）进行反转录。随后进行RT-qPCR反应，扩增目的基因产物，条件：95 ℃、30 s预变性，95 ℃、10 s变性，60 ℃、30 s退火延伸，40个循环。计算ΔCt值，以2^-ΔΔCt分析各基因相对表达量。从Gene bank查找目的基因CDS序列，利用Primer 5.0设计引物，并委托上海铂尚生物技术有限公司合成，以β-actin为内参，引物序列见表1。

3  统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，若服从正态分布，多重组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验;若不服从正态分布，则采用非参数Kruskal-Wallis检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  一般状况

正常组大鼠精神、饮食与大便等均无异常，活泼好动，皮毛光泽;模型组大鼠精神和饮食均欠佳，皮毛无光泽，慵懒不好動;痛风宁低剂量组大鼠精神略有疲倦，饮食削减，皮毛欠光泽，活动减少，大便正常;痛风宁中、高剂量组大鼠精神与活动尚可，饮食、大便正常，皮毛欠光泽;秋水仙碱组大鼠出现精神不佳，饮食锐减，皮毛干枯，慵懒不好动，大便稀溏等。

4.2  痛风宁对大鼠关节液白细胞介素-1β、前列腺素E₂含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠各时点IL-1β、PGE₂含量均明显增加（P<0.01）;与模型组比较，痛风宁中、高剂量组及秋水仙碱组大鼠各时间点IL-1β、PGE₂含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;与秋水仙碱组比，痛风宁中、高剂量组大鼠各时间点IL-1β、PGE₂含量无明显差异，痛风宁低剂量组大鼠则明显升高（P<0.01，P<0.05）。见表2、表3。

4.3  痛风宁对大鼠关节滑膜组织NALP3、ASC、Caspase-1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠各时点NALP3、ASC、Caspase-1蛋白表达均明显升高（P<0.01）;与模型组比较，痛风宁中、高剂量组和秋水仙碱组大鼠各时间点NALP3、ASC、Caspase-1蛋白表达明显降低（P<0.01，P<0.05）;与秋水仙碱组比较，痛风宁中、高剂量组大鼠各时间点NALP3、ASC、Caspase-1蛋白表达无明显差异，痛风宁低剂量组大鼠则明显升高（P<0.01，P<0.05）。见表4～表6、图1。

4.4  痛风宁对大鼠关节滑膜组织NALP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠各时间点NALP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达均明显升高（P<0.01）;与模型组比较，痛风宁中、高剂量组和秋水仙碱组大鼠各时间点NALP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达明显降低（P<0.01，P<0.05）;与秋水仙碱组比较，痛风宁中、高剂量组大鼠各时间点NALP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达无明显差异，痛风宁低剂量组表达明显升高（P<0.01，P<0.05）。见表7～表9。

5  讨论

中医历代医家对痛风急性发作期和慢性关节炎期的临床表现颇有论述，常将其归为“痹证”“历节风”等范畴。但目前关于痛风病因病机的认识尚未一致，经课题组前期梳理总结，认为内生湿浊为痛风发病关键，“内湿”滋生稽留，郁久化热，致气血运行不畅则留瘀，湿浊瘀热积滞，痹阻筋脉肢节，发为痛风。故针对痛风“内湿致痹”的病机特点，创制具有清热利湿、消肿止痛功效的痛风宁。方中黄柏长于清下焦湿热，苍术长于燥湿健脾，二药共奏清热燥湿之功，加之川牛膝引药下行，导湿外出，兼以活血通经，三药合用谓之三妙丸，常用于湿热下注之痹证;土茯苓、萆薢、泽泻、金钱草皆有所长，共行利湿泄浊、清热解毒、通利关节之功;丹参、秦艽、肿节风皆属入血之品，共行清热凉血、活血祛瘀、消肿止痛之功。诸药合用以达标本兼治之效。

研究表明，固有免疫中NOD样受体成员NALP3可感受到病原菌入侵及机体损伤信号，形成炎性体，引起免疫防御反应^[12-13]。当细胞内无活性NALP3蛋白在识别MSU被激活后，募集ASC、Caspase-1蛋白形成NALP3炎性体，继而活化的Caspase-1切割IL-1β前体生成IL-1β，并分泌到胞外，同时IL-1β激活COX-2，促进PGE₂合成，引发关节局部红、肿、热、痛等，导致AGA发生^[14-16]。可见，NALP3炎性体信号通路在痛风急性发作过程中发挥关键作用。

本研究发现，模型组大鼠IL-1β、PGE₂含量增加及NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达升高，且随时间呈升高趋势，而且痛风炎症反应在一定时间内随时间加重，这与AGA部分特征类似;痛风宁各剂量组及秋水仙碱组均可抑制NALP3炎性体相关蛋白合成，降低下游炎症因子IL-1β、PGE₂含量，表明痛风宁与秋水仙碱对该通路具有明显抑制作用，或存在多靶点效应，可同时干预信号通路上下游。现代药理研究表明，土茯苓有效成分总黄酮能减轻关节局部炎症反应，消除关节肿胀，且其抗痛风关节炎作用与NALP3炎性体关系密切^[17]。黄柏生物碱与苍术糖苷类成分能抑制关节液中炎症因子IL-1β和IL-6水平，减轻关节炎症损伤，治疗痛风效果良好^[18]。同时，各剂量组在首次干预后48 h下调NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达幅度以及减少IL-1β、PGE₂含量明显优于其余3个时点，说明痛风宁首次干预后48 h抗炎作用相对明显。另外，各时点痛风宁中、高剂量对IL-1β、PGE₂含量抑制与秋水仙碱比较无明显差异，但低剂量抑制作用不佳;高剂量抗炎作用稍优于中剂量，可能因为高剂量药物浓度较高，其抗炎效应短时间内快速发挥，随着时间推移，药物浓度达到饱和，抗炎效应达到峰值，这与我们观察到痛风宁中、高剂量在12、24、48 h抗炎效应相当的现象一致。中药复方中不同成分的药理作用不同，如果单纯增加剂量可能会出现药理作用相互抵消，剂量过大或可出现严重毒副作用。鉴于用药安全和疗效，我们提出中剂量为痛风宁相对理想剂量，更适用于临床。

综上，中剂量痛风宁在下调NALP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA的表达，以及降低IL-1β、PGE₂炎症因子含量方面的作用相对较佳，且首次干预后48 h时抗炎作用相对明显。

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（收稿日期：2019-06-08）

（修回日期：2019-07-17;编辑：华强）

基金项目：国家自然科学基金（81473495）

通讯作者：苏友新，E-mail：suyouxin777@hotmail.com