慢病毒介导miR-203过表达对酒精性肝病大鼠肝损伤的保护作用及其机制研究*

黄橘村，胡东辉，张建军，田德英

MicroRNA-203( miR-203)是miRNAs家族中重要的成员。MiR-203位于人染色体14q32.33，该区域属于不稳定区域，编码人类约12%miRNA[1]。研究发现，miR-203与肿瘤的发生发展密切相关，miR-203过表达后有抑癌作用[2]。也有研究表明，miR-203对于人类皮肤的形态发育和功能维持有调控作用[3]。目前，关于miR-203的研究很多，但是miR-203对酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)影响的研究还较少。ALD主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化等，其主要的致病原因就是长期过量饮酒。研究发现，ALD与机体的氧化应激、细胞转化因子表达和炎症介质释放等有关[4]。本研究采用慢病毒介导miR-203过表达观察了ALD大鼠肝组织氧化损伤和炎症反应的变化，以探讨miR-203参与ALD发病的机制。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试剂 SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g(由湖南长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物质量合格证编号：43006700005608)。相差显微镜(Leica)，多功能酶标仪(Thermo Scientific MultiSkan Go)，PCR分析仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)，电泳仪电源(Tanon)，全自动生化分析仪(日本日立公司)。红星二锅头酒(北京红星股份有限公司，批号：6906785230165)。miR-203慢病毒质粒(上海吉玛基因股份有限公司)。检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)试剂盒(北京利德曼生化技术有限公司)。检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。抗-actin抗体(PTG)、抗NF-κB和抗IL-1β抗体(Abcam)。BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime Biotechnology)。

1.2 慢病毒介导的miR-203过表达和ALD大鼠模型的建立[5]取60只SD大鼠，随机分为A组：即ALD组，B组：即NC-miRNA/ALD和C组：即miR-203/ALD。在建立ALD大鼠模型前，在B组大鼠，使用胰岛素注射器通过尾静脉注射NC-miRNA慢病毒空质粒，作为阴性对照，在C组大鼠，注入miR-203慢病毒表达质粒。在病毒感染后第1 d，给予各组大鼠随意饮用5%酒精，连续3 d，第4 d换成10%酒精，以后每隔1 w增加2%酒精浓度，直至达到22%酒精。自饮用22%酒精开始，给予54%酒精2 mL.d-1分3次灌胃，连续8 w。

1.3 大鼠肝组织miR-203水平检测 在造模8 w，麻醉处死大鼠，取肝组织，置于10%福尔马林溶液中固定，行石蜡包埋、切片、HE染色，并在光镜下观察。另取肝组织，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，采用TaqMan Small RNA Assays行miR-203逆转录反应，再采用Realtime PCR法检测，采用2-ΔΔCt法计算miR-203水平。正向引物序列：5’GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3’，反向引物序列：5’-CCAGUGGUUCUUAACAGUUCAAC-3’。

1.4 肝组织匀浆SOD、CAT和MDA检测 在造模8 w处死大鼠，取新鲜的肝组织匀浆，采用ELISA法检测。

1.5 肝组织IL-1β和细胞核NF-κB蛋白表达检测 另取肝组织，分别采用细胞核提取试剂盒或普通组织裂解液裂解肝组织，低温离心，取上清液采用BCA试剂盒进行蛋白定量，配胶，采用Western Blot法检测，经琼脂糖凝胶电泳，转膜，封闭，加一抗4℃过夜，加二抗孵育2 h，显影，进行半定量分析。

2 结果

2.1 各组ALD大鼠血生化指标变化的比较 C组动物血清AST、ALT和TBIL水平显著低于B组(P<0.05，表1)。

表1 各组大鼠血清生化指标比较

与其他两组比，①P<0.05

2.2 两组大鼠肝组织miR-203水平比较 在构建ALD模型8 w末，经Realtime PCR法检测发现，C组大鼠肝组织miR-203水平为(2.8±0.1)，显著高于B组【(1.3±0.5)，P<0.05】，表明慢病毒介导的miR-203过表达ALD大鼠模型成功建立。

2.3 各组肝组织病理学表现比较 A组大鼠肝细胞坏死、空泡变性，有炎性细胞浸润；B组动物肝组织与A组表现相似；C组大鼠肝小叶内偶见肝细胞坏死，有少量的炎性细胞浸润(图 1)，结果表明miR-203过表达对于ALD大鼠肝组织损伤有明显的保护作用。

图1 三组大鼠肝组织形态学观察(HE，×400)

2.4 各组大鼠肝脏组织SOD、CAT和MDA水平比较 C组肝组织SOD和CAT水平显著高于，而MDA水平显著低于B组或A组(P<0.05，表2)，说明miR-203过表达能显著提高肝组织的抗氧化能力，从而减轻肝损伤。

表2 各组大鼠肝组织SOD、CAT和MDA水平比较

与其他两组比，①P<0.05

2.5 各组大鼠肝组织NF-κB和IL-1β表达情况的比较 经Western Blot检测结果表明，A组和B组肝组织NF-κB和IL-1β蛋白表达水平均显著增强，说明导入空载体质粒对于肝损伤无明显影响。与B组比，C组肝组织IL-1β蛋白和NF-κB蛋白表达明显减弱(图2，表3)，说明miR-203过表达后可能通过抗氧化和抗炎作用机制对肝组织起到了保护作用。

图2 各组肝组织NF-κB和IL-1β蛋白表达比较

表3 各组大鼠肝组织IL-1β和NF-κB蛋白比较

与其他两组比，①P<0.05

3 讨论

MiRNA是现代分子生物学领域里研究的热点[6]。随着研究的深入，miR-203的作用逐渐被发现被认知[7-10]，miR-203在皮肤上皮组织生理、病理过程中有着重要的作用。MiR-203具有诱导细胞分化、促进细胞自噬、细胞凋亡和抑癌等作用，其在各种疾病中的具体作用都有待进一步阐明[11-14]。MiRNA203在ALD发病过程中的作用鲜有报道。有研究表明，miR-203对胃癌细胞的迁徙和细胞凋亡均有影响，能够促进胃癌细胞的凋亡，有抗胃癌的作用[15]。本研究表明，通过慢病毒转染大鼠miR-203，在大鼠肝脏组织中出现miR-203过表达，并且miR-203过表达后对于肝组织的病理损伤也能起到一定的保护作用。

一般将ALD分为急性和慢性肝损伤，严重酗酒或长期大量饮酒都会造成ALD。ALD的具体发病机制比较复杂，目前比较公认的发病机制有：乙醇及其代谢产物对肝脏有直接的毒副作用，乙醇还会诱导细胞发生氧化应激以及脂质过氧化，细胞在氧化应激的状态下会产生一些内毒素、细胞因子和炎性介质等介导的炎性反应。乙醇可能会使细胞缺氧，进而导致细胞损伤。但是，目前尚未有具体明确的致病机制[16]。在肝脏受到损伤时，ALT和AST会从细胞内渗出，释放到血液中。血清ALT、AST和TBIL水平升高在一定程度上能够反映肝细胞损伤的程度[17]。为了考察miR-203对ALD大鼠肝损伤的影响，我们检测了各组动物血清ALT、AST和TBIL水平，结果C组大鼠血清ALT、AST和TBIL水平比B组显著下降，提示miR-203具有保护肝细胞的作用，减轻了ALD动物肝细胞的损伤。ALD的损伤是很多因素共同导致的结果，其中还包括氧化应激反应、炎症、细胞凋亡、缺氧、细胞因子作用等。在ALD个体，乙醇会改变肠粘膜的通透性，引起胃粘膜损伤，进而抑制SOD和CAT的酶活性，并增加MDA的产量[18]。SOD、CAT和MDA是与细胞氧化应激相关的指标，为了进一步探讨miR-203对肝损伤的作用，我们又检测了肝组织损伤后一些指标的变化，结果发现C组与B组比，肝组织匀浆CAT和SOD含量明显升高，提示miR-203具有提高机体抗氧化能力。与B组相比，C组大鼠肝组织MDA含量显著降低(P<0.05)。MDA作为膜脂质过氧化物最重要的终产物，其含量反映了机体脂质过氧化程度，间接反映肝细胞的受损程度。乙醇过量会诱导NF-κB等转录因子的磷酸化和核转位，促使一些细胞因子的释放，如IL-1β和IL-6等。NF-κB是细胞中重要的转录因子，与炎性介质的转录表达和免疫反应的调控相关。当细胞处于正常状态时，NF-κB在胞浆中处于非活性状态，当细胞受到一些外部刺激如缺氧、氧化应激、炎症反应时，NF-κB均可被激活[19,20]。NF-κB会从胞浆中进入细胞核，从而使细胞核NF-κB明显增多。核NF-κB激活后会激活其他信号通路的相关蛋白，进而引起级联放大效应，会使人体出现更多的后续反应。为了考察miR-203的抗炎作用机制，我们采用Western Blot法检测了促炎因子IL-1β和核转录因子NF-κB水平，结果C组大鼠肝细胞NF-κB和IL-1β表达显著低于B组，实验结果提示miR-203与NF-κB和IL-1β相关的炎症反应有关。

综上所述，miR-203过表达对ALD动物肝损伤有明显的保护作用，其可能是通过抗氧化和抗炎作用，从而对ALD起到了保护作用。