神经脱细胞基质凝胶/BMP-2/脱钙骨复合材料的制备及性能*

刘 艳，朱继翔，陈 炜，朱郇悯, 陈晓明

(广州医科大学 基础医学院生物医学工程系，广州 511436)

0 引 言

骨缺损病例在临床治疗中十分常见，常造成骨不连接，延迟愈合或不愈合及局部的功能障碍，影响人们生活质量甚至威胁生命。目前，临床上通常采用的骨修复材料仍存在成骨活性不高的问题,难以满足临床需求[1]。脱钙骨基质(demineratized bone matrix，DBM)是一种天然骨衍生材料，自20世纪60年代人们就对其做了大量研究，DBM含有促进骨等硬组织形成所必须的生物活性物质,具有优异的性能[2]。早在 1965年 Urist用同种脱钙骨基质诱发肌肉内异位成骨,证实了骨诱导学说,首次提出 DBM 具有诱导成骨的能力[3]。DBM具有传导和诱导骨形成的双重作用，是一种理想的骨组织工程支架材料,大量研究证明DBM种植体可应用于骨缺损修复。然而DBM的临床应用尚存在一些不足，骨诱导因子在制备过程中通常会被消除或降低，不具备足够的骨诱导活性；另一方面，DBM中的生长因子释放可能是不连续的, 可能会影响它的骨诱导活性。

研究发现骨形态发生蛋白-2(BMP-2)可以提高DBM的骨诱导活性[4]。BMP-2能单独诱导异位成骨和单独促进骨缺损修复，骨组织工程常将生物活性大分子与支架结合来增加材料的骨诱导活性[5]。如果将血管内皮生长因子(VEGF)、BMP-2等复合到DBM中,可以得到更好的成骨效果[6]。

脱细胞组织的细胞外基质(ECM)作为支架在组织工程有广泛的应用，并且越来越普遍，其制备形式多，包括片，粉末和水凝胶[7]。制备ECM的组织来源广泛，如真皮、膀胱、心肌、脑、心包、小肠粘膜下层、脊髓、脂肪等[7-12]。完整的ECM支架材料具有三维网络结构，保留了天然组织中发现的大量生物活性成分，如层粘连蛋白、细胞粘附蛋白，生长因子和糖胺聚糖等。由天然的生物组织制备的凝胶比通过合成制备的凝胶具有更好生物相容性和更高的生物活性。脱细胞基质凝胶的成分和结构符合仿生学的要求，具有强大的潜力[13]。

本研究旨在制备出具有缓释生长因子功能的DBM复合神经脱细胞基质凝胶的复合材料，并考察其能否满足构建结构性组织工程骨组织的需要。

1 实 验

1.1 实验材料及试剂

猪干骨、猪脊髓、Triton-100(MYM BIOLOGICAL TECHNOLOGY COMPANY)、脱氧胆酸钠(BIOSHARP)、双氧水(SCR，分析纯)、盐酸、京尼平(WaKo 和光)、人骨形态发生蛋白-2(BMP-2 Novoprotein)

1.2 神经脱细胞基质凝胶/BMP-2/脱钙骨复合材料的制备

取新鲜猪干骨,处理干净，在30%过氧化氢条件下处理48 h；室温下用蒸馏水反复浸洗30 min；用改良脱钙液浸泡72 h，每24 h换液；蒸馏水反复浸洗30 min,真空冷冻干燥机干燥24 h，将脱钙骨(DBM)切成1 cm×1 cm×0.5 cm。

取新鲜猪脊髓，剪去表面脂肪组织和部分神经外膜，置于蒸馏水漂洗6 h；3% Trition-X100震荡12 h；蒸馏水漂洗3次；4% 脱氧胆酸钠水溶液震荡24 h；蒸馏水漂洗3次。上述步骤再循环一次制得脱细胞神经组织。神经脱细胞组织经冷冻干燥后粉碎，加入胃蛋白酶、0.01 mol/L HCL制得脱细胞神经预凝胶,加入0.1 mol/L NaOH、10×PBS,获得脱细胞神经凝胶溶液；加入BMP-2;分别加入1%京尼平、2%京尼平、3%京尼平，室温下放置数分钟后形成凝胶。

将神经脱细胞(NAM)凝胶在真空抽滤装置下灌注到制备好的脱钙骨中，加入40 μL脱细胞神经凝胶充满脱钙骨孔隙，每40 μL脱细胞神经凝胶含有0.8 μg BMP-2。冷冻真空冷冻干燥神经脱细胞凝胶/京尼平/脱钙骨。根据加入的京尼平含量不同，将其分组为NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3。

1.3 复合材料性能

1.3.1 复合材料扫描电子显微镜观察

取β-TCP、DBM、NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3支架，用真空冷冻干燥器干燥后，表面喷金后扫描电镜观察。

1.3.2 材料力学性能测试

制备尺寸为8 mm×15 mm×5 mm DBM和β-TCP和NAM/DBM三组样品，使用万能拉力压缩测试仪进行单轴压缩试验，压缩速率为20 mm/min。

1.3.3 BMP-2体外释放研究

将NAM/BMP-2/DBM1、NAM/BMP-2/DBM2、NAM/BMP-2/DBM3分别浸泡在装有500 μL PBS的1 mL试管中，放置于37 ℃、80 r/min恒定转速的恒温培养箱中。在设定取样时间点内取样，每次将500 μL液体取完，重新加入500 μL PBS。根据ELISA试剂盒测定3组支架中BMP-2的释放量，通过式(1)计算得BMP-2累积释放率,n=4。

累积释放率=(Ct1V+…+CtnV)/0.8×100

(1)

其中，Ctn为n时间点取样时BMP-2浓度

1.3.4 细胞-支架共培养

将β-TCP、DBM、NAM/DBM制备成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，用75%乙醇浸泡30 min，紫外照射30 min消毒，PBS清洗3次后置于6孔板中。将MC3T3-E1细胞分别种植到3种支架上，每孔细胞数量为1×105个细胞。用含有10%FBS,1%双抗的α-MEM培养液(Gibco)在37 ℃，5%CO2培养箱中培养，两天换一次液。培养1天后用多聚甲醛固定后，扫描电镜观察细胞在支架上形态；细胞-支架共培养1、3、5、7d后用CCK-8试剂盒检测MC3T3-E1细胞在支架上增值情况并用Dead/Live试剂盒进行染色，正置荧光显微镜观察；细胞-支架共培养3、7、14 d后，用ALP试剂盒、BCA试剂盒检测其碱性磷酸酶活性。

1.4 统计学处理

实验中所有统计分析均使用SPSS进行。结果表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析用于检验统计学显着性，P<0.05被认为是指示统计学显著性。

2 结果与讨论

2.1 脱钙骨复合脱细胞神经基质凝胶支架表面结构及力学性能

骨支架作为种子细胞和生长因子的载体，是骨组织修复的关键。骨支架的微观结构和材料性能对骨修复和再生有重要影响。由图1(a)、(c)可知，DBM为三维多孔网状结构，孔径为152～529 μm,孔洞相互贯通，具有天然的孔隙，简单易得，大孔径有利于营养物质运输和血管长入。图1(b)、(d)为β-TCP表面形貌，β-TCP，孔径为105～408 μm,其孔隙比DBM小，密度较高。

由于支架材料是多孔的，NAM凝胶可以整合在DBM基质,增大内表面积[14]。NAM凝胶属于生物来源凝胶，来源于生物组织的细胞外基质，其成分和结构符合仿生学要求，研究发现NAM凝胶是目前最接近细胞生长天然环境的支架材料[15]。NAM凝胶当未使用交联剂时，只有少量NAM凝胶与DBM复合(图2(b);交联剂含量为1%时复合的NAM凝胶量比无交联剂时多(图2(c)；交联剂含量为2%时复合的NAM凝胶量明显增多(图2(d)；交联剂含量为3%时复合的NAM凝胶量最高(图2(e)。由图2可知DBM与NAM凝胶的复合程度与交联剂含量呈正比，复合材料的交联剂含量越高，DBM交联NAM凝胶量越多。

支架的力学性能对骨组织修复具有重要的影响。适当的力学强度是理想的骨组织工程材料要求之一。由图3(a)、(b)可知β-TCP组的抗压强度显著高于DBM、NAM/DBM,β-TCP组密度比其他两组材料密度高。图3(b)中β-TCP的抗压强度为(20.5±1.26)MPa,DBM的抗压强度为(1.04±0.44)MPa, NAM/DBM的抗压强度为(1.00±0.30)MPa.脱钙骨复合脱细胞基质凝胶后，抗压强度稍低于未复合脱细胞基质凝胶，但两组材料的抗压强度没有显著性差异,结果表明复合凝胶对DBM的力学性能没有影响。

图2 DBM、NAM/DBM、NAM/Genipin/DBM 扫描电镜图

图3 力学性能

2.2 体外BMP-2释放动力学

NAM凝胶是一类可吸收保持大量水分但不溶于水的三维生物材料[13]。将BMP-2溶于蒸馏水，利用NAM凝胶可吸收保持大量水分但不溶于水的特性可使NAM凝胶负载一定量的BMP-2。Genipin是一种天然优良的生物交联剂，研究发现在水凝胶中添加一定量交联剂可以减慢其降解速度。不同含量的Genipin与神经脱细胞基质凝胶形成的网络交联和溶胀度可影响释放行为[16]。在NAM凝胶中加入Genipin可以延长降解时间，增加BMP-2持续释放时间。在早期研究基础上，本文探讨了Genipin的量对BMP-2释放规律的影响。结果表明，交联剂量为3%的复合支架组缓释量最大，缓释效果最佳。复合支架中BMP-2释放情况如图4所示。在释放前13天，当Genipin用量为2%时,复合材料中BMP-2释放率高于Genipin用量为1%、3%的复合材料中的BMP-2。释放中后期，Genipin量为3%一组的复合支架释放BMP-2量明显高于含Genipin量为1%、2%的两组复合支架，在34d内释放总量达到34%±4%，其累积释放与释放时间呈现线性增长，无暴释现象发生。

图4 BMP-2累计释放曲线图

2.3 细胞在支架上生长

将MC3T3-E1细胞种植到复合支架上来考察负载BMP-2的复合支架对细胞生长的影响。MC3T3-E1细胞-支架复合培养1d后，通过扫描电子显微镜观察，可见细胞在NAM/DBM(图5(a))、β-TCP(图5(b))上呈圆形贴附于材料表面生长。在NAM/DBM材料表面，粘附的细胞数量多，部分细胞形态开始改变，并分泌出少量基质，在β-TCP材料表面，粘附细胞数量较少，细胞大部分长出触角。NAM凝胶具有良好的生物相容性和亲水性，细胞易于粘附在其表面。另外，NAM凝胶支架具备多空网状结构，有利于细胞向内生长[15]。MC3T3-E1细胞培养第1、3、5、7 d用正置荧光显微镜观察其在材料表面生长情况。活细胞(绿色)填充于支架孔隙，未见死细胞(红色)。培养时间延长，材料表面细胞逐渐增多，细胞生长状态逐渐变好，总体呈现较好的增值趋势。在第7天时，细胞在NAM/DBM(图6d)、β-TCP(图6(h))支架上大部分都铺展开呈梭形，生长情况最佳。

图5 细胞-支架复合培养1d扫描电镜观察

MC3T3-E1细胞在不同材料上1、3、5、7 d天后用CCK-8试剂盒验证细胞在支架材料上的情况。从图7可以看出随着培养时间的延长，各组的吸光度值都逐渐增高。在第3、5、7天负载BMP-2因子的支架材料细胞活性显著高于DBM和β-TCP组。结合图5证明负载BMP-2的脱细胞神经凝胶对细胞的生长具有促进作用，NAM/BMP-2/DBM支架可以促进细胞增殖, NAM/BMP-2/DBM支架材料对细胞无毒性作用，是一种有效负载BMP-2的方法。

图6 MC3T3-E1细胞-支架复合培养1、3、5、7d 死/活细胞染色(正置荧光显微镜)

ALP活性表达是成骨细胞分化的一个特征，高ALP活性有利于成骨作用。用ALP试剂盒检测MC3T3-E1细胞在不同材料上培养3、7、14d后ALP活性值。在第14天，负载BMP-2的支架和β-TCP上的细胞显示出最大的ALP活性。在第7、14天，负载BMP-2的支架上细胞ALP活性显著高于β-TCP，表明NAM/BMP-2/DBM 支架具有良好促成骨分化作用。

图7 支架材料CCK-8活性

图8 ALP活性

3 结 论

通过上述实验研究，可得出以下结论：

(1)神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨材料具有良好的三维网状孔隙结构，孔径约152～529 μm ,互相连通，有利于骨组织长入；

(2)神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨材料可缓释BMP-2，京尼平含量为3%时，可持续释放至少34 d，累积释放量为34%，期间无暴释现象发生，表明以京尼平为交联剂制备神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨可有效地复合BMP-2并且具有缓释BMP-2的功能。

(3)神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨材料无细胞毒性，MC3T3-E1细胞在材料上生长状况良好，随着时间增长不断增殖，表明神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨材料具有良好的生物相容性；

(4)神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨材料的ALP活性在第7、14天显著高于β-TCP组，表明其具有较高的成骨活性。

(5)综合神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨材料的微观结构、药物缓释作用、生物相容性和成骨分化活性各方面的评价，神经脱细胞基质凝胶复合脱钙骨材料有望成为一种理想的骨修复材料。