MAPK信号通路基因在雷州山羊不同生长发育阶段表达规律研究

黄 强，陈智成，练志全，邓 铭，蔡丹凤，侯云飞，杨健华，李耀坤

（华南农业大学 动物科学学院，广东 广州 510642）

MAPK信号通路中，Ras/Raf/Mek（丝裂原活化蛋白激酶/Erk激酶）/Erk（细胞外信号调节激酶）途径是控制细胞增殖、分化和存活的信号传导网络的核心[1-3]，主要起正调控作用；Erk的激活对细胞增殖至关重要[4]；Ras蛋白是Mek/Erk通路的激活因子，不仅能促进脂肪细胞的分化[5]，也能促进成骨基因表达和成骨细胞增殖[6]。另有研究发现，山羊背最长肌组织的mRNA组学特性，在不同发育阶段，呈现明显的时序表达特征[7]。山羊至少有三个肌发生波，在胎儿发育的中后期（85 d左右）肌细胞明显增加[8]。动物骨骼肌形成和发育机制一直是研究的热点，关于动物肌肉生长和发育的基因调控已有很多报道，但大部分是检测单个基因的在动物组织的表达情况[9]，关于调控山羊肌肉生长发育的通路基因报道较少。

本次研究通过分析MAPK信号通路中Ras/Raf/Mek通路基因在雷州山羊不同生长发育时期背最长肌的表达情况，探究影响雷州山羊背最长肌生长发育的关键基因。实验检测了雷州山羊胎儿期90 d、100 d、120 d及出生后3月龄、6月龄的雷州山羊背最长肌的Ras/Raf/Mek通路基因表达水平，为进一步研究雷州山羊肌肉生长发育机制提供理论参考依据。

1 材料

1.1 实验动物

雷州山羊妊娠第90 d、100 d、120 d胎儿各3只，及出生后3月龄、6月龄雷州山羊各2只，由温氏羊业有限公司提供。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒（型号为Total RNA Kit II R6934），购自OMEGA公司。

1.3 主要仪器

超净工作台（型号为SW-CJ-1B），购自中国苏净集团；高速冷冻离心机（型号为MicroCL 17R），微量核酸蛋白质测定仪（型号为Nano-200），实时荧光定量PCR仪（型号为QuantStudio 7 Flex System），均购自赛默飞世尔科技公司。

2 方法

2.1 总RNA提取和反转录

采用OMEGA Total RNA Kit II R6934试剂盒对动物组织总RNA进行抽提，RNA用ND2000超微量核酸蛋白质测定仪检测抽提得到的RNA的OD值和浓度，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性及是否存在DNA和蛋白质的污染。

去DNA反应体系：5×DNA Eraser Buffer 2µl，gDNA 1 µl，Total RNA 7 µl。加完后混匀、离心、PCR仪按设置好的程序运行。

反转录体系为：去DNA反应液 10 µl，Prime ScriPt RT Enzyme MixⅠµl，RTPrimer mix 1 µl，5×Primer ScriPt Buffer 4 µl，RNA-free H2O 4 µl。加完后混匀离心，PCR仪按设置好的程序运行。反转录后的cDNA放置-20 ℃冰箱保存。

2.2 引物设计

根据GenBank (httP://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的候选基因序列，以及通过查询资料和引用其他文献资料，采用Primer Premier 5.0软件设计获得下列引物，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物信息见表1。

2.3 实时荧光定量PCR

本实验采用SYBRGreen染料法进行荧光定量PCR反应。荧光定量PCR的反应体系为：上、下游引物各0.3µl，2×SYBRGreen荧光染料5µl，cDNA模板1 µl，加ddH2O补至总体积10 µl；荧光定量PCR的扩增程序为：45个循环（95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s）；58℃检测荧光值；15℃保存。

表1 荧光定量Q-PCR所用引物的相关信息

2.4 统计分析

本实验采用2-ΔΔCt法计算各个基因的mRNA相对表达量，以β-Actin为内参基因进行标准化校准。所得数据采用SPSS 20.0统计软件One-way ANOVA进行分析。

3 结果与分析

3.1 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因的组织表达谱

采用qRT-PCR技术，以β-actin作为内参，以肾组织为参照，结果表明（图1）Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在8个组织中均有表达。Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最长肌和心脏中的表达量最高，在下丘脑、肝、脾、肺和垂体中的表达量较低。

图1 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因的组织表达谱分析

3.2 不同生长发育时期Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最长肌的表达情况

Ras基因在胎儿发育120 d龄时的表达量最高，表达模式为：120 d＞100 d＞90 d＞6月龄＞3月龄，120 d龄胎儿背最长肌中的基因表达量显著高于6月龄羔羊。Raf基因在羔羊3月龄的表达量最高，3月龄羔羊的表达量显著高于90 d和100 d胎儿。RafA基因在胎儿发育120 d龄时的表达量达到最高，90 d龄的表达量最低，在出生后6月龄的表达量高于3月龄，但各组间基因的表达量差异不显著。Mek1基因在120 d的表达量显著高于其它组，其余组间基因的表达量差异不显著。Mek2基因在胎儿期120 d的时候基因的表达量最高，120 d的表达量显著高于100 d；90 d、100 d、3月龄和6月龄的基因表达量没有显著差异（图2）。

图2 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最长肌的表达情况

3.3 不同生长发育时期Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在心脏的表达变化规律

Ras基因在羔羊3月龄时的表达量最高，在胎儿期100 d的表达量最低，表达模式为：3月龄＞90 d＞6月龄＞90 d＞100 d，3月龄羔羊心脏中的基因表达量显著高于其它组。Raf基因在羔羊3月龄的表达量最高，100 d龄的表达量最低，3月龄羔羊的表达量显著高于其它组。表达模式为：3月龄＞6月龄＞120 d＞90 d＞100 d。RafA基因在羔羊3月龄时表达量最高，3月龄基因的表达量显著高于其它组。Mek1基因在胎儿期120 d的表达量显著高于其它组，3月龄和6月龄羔羊表达量显著高于胎儿期90 d和100 d。Mek2基因在羔羊3月龄时基因的表达量最高，3月龄的基因表达量显著高于其它组，90 d、100 d、120 d和6月龄的基因表达量没有显著差异（图3）。

图3 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在心脏的表达情况

4 讨论

雷州山羊是我国著名的地方优良品种，也是广东省唯一的肉用羊地方良种。雷州山羊具有瘦肉多、脂肪少、膻味轻、营养丰富、味美多汁、易消化吸收等特点，深受消费者青睐[10]，其市场需求量巨大，市场前景十分广阔，具有较大开发潜力。但近年来，雷州山羊品种退化十分严重，产肉性能在逐年下降[11]，针对优质山羊品种存在的生长不稳定、生长速度慢等问题，本研究通过分析MAPK信号通路中相关基因在雷州山羊各个生长发育时期的表达规律，为雷州山羊背最长肌的生长发育的分子机理的阐明提供证据，同时也为肉羊生长发育机制提供科学依据。MAPK信号通路中的Ras/Raf/Mek/Erk细胞信号传递通路是由一个GTP结合蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶级联反应介导，其活化的中心是使Ras进行鸟苷酸交换变成其活化形式Ras-GTP[12]。该通路可由活性氧、Ca2+、蛋白激酶C等激活，参与体内的多种生理生化功能，对细胞生长、分化、增殖、发育、凋亡均有影响[13]。Ras的表达对Raf有促进作用，其机理为Ras-GTP直接与Raf结合，形成一个临时的膜锚定信号。而活化的Raf再通过磷酸化促进分裂原激活蛋白激酶的激酶（Mek）环上的丝氨酸残基而将其激活[14]。Mek/Erk通路参与了胰岛素调控骨骼肌成肌细胞增殖，具有促增殖或抗凋亡作用，是多途径多通路的信号转导过程[15]，抑制此通路，可以抑制平滑肌的增殖[16]，也可以抑制骨骼的细胞增殖、成熟和钙沉积[17]。小鼠敲除Raf基因实验表明，Raf基因在各组织生成中均具有一定功能[18]，尤其对胎儿生长发育发挥关键作用。基于上述原因，如果能确定Ras/Raf/Mek信号通路基因在雷州山羊背最长肌表达量的差异和表达规律，就可采用基因敲除、转基因、注射抗体、反义核酸等技术，控制其表达量，从而使其背最长肌充分发育，提高动物的生长性能。另一方面，通过有关基因表达量与生长发育规律相联系，有助于掌握雷州山羊生长发育特点，以便在妊娠母羊胎儿生长发育关键时期和正常的生长发育时期合理调控外界环境和营养条件，充分挖掘其生长潜能。

雷州山羊的组织表达谱分析结果显示，Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因均在雷州山羊的背最长肌有较高的表达量，说明其对调控肌肉生长发育有重要作用。在心脏组织中，3月龄羔羊的Ras、Raf、RafA和Mek2基因表达量显著高于其他组，Mek1在胎儿期120 d表达量显著高于其他组。小鼠心脏发育开始于胚胎发育期的第7.5天，在胚胎第11.5天之后心肌细胞大量增殖，促心生长因子有Hedgehog、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPSs)、成纤维生长因子（firbroblast groth factors, FGFs）和非经典Wnt/JNK通路[19]，但关于山羊心脏发育过程中的分子调控研究报道较少，本文可为雷州山羊心脏生长发育机制提供一定的理论参考。在所研究的雷州山羊胎儿期的三个生长阶段，Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因均在120 d表达量最高；表达模式为：120 d＞100 d＞90 d。120 d Mek1基因mRNA的表达量显著高于100 d、90 d的基因表达量山羊妊娠周期为150 d，其胎儿生长发育后期（60 d以后）增长的体重占初生重90%，在妊娠后期胎儿的生长发育速度越来越快。本研究结果表明，Ras/Raf/Mek信号通路基因在雷州山羊的背最长肌发育中呈相同的表达模式，此通路对细胞的生长、增殖发挥着关键的作用[20]。根据实验结果推测，雷州山羊在胎儿生长发育120 d的时候有一个肌肉发生波。综合判断，Ras/Raf/Mek信号通路在雷州山羊胎儿生长发育后期起关键作用，并且起正调控作用，但具体机制尚不明确。通过分析3月龄、6月龄相关基因表达情况，并未发现较明显的基因表达模式，可能该通路基因在出生后的调控机制发生了变化，具体的调控机制仍有待深入分析。