人舌癌耐药细胞株OSC-19/CDDP 的多药耐药性检测及差异性表达microRNAs 的筛选

杨晓红， 胡小华， 钟雯怡， 杨 琨， 易 杰， 姚 礼， 张立刚

（遵义医科大学附属口腔医学院，贵州 遵义 563000）

舌癌是最常见的口腔恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的1.19%。 舌癌的治疗方法主要为手术、放疗、化疗或中西医综合治疗[1]。 含CDDP 的化疗方案一直是首选且高效的治疗方案，然而3～5 个疗程的化疗往往收效甚微，这是由于耐药性的产生使化疗药物起不到其应有的作用。 因此，如何解决耐药问题是抗肿瘤研究的当务之急。

肿瘤耐药可分为原发性耐药和获得性耐药，而获得性耐药可分为原药耐药 （primary drug resistance，PDR）和多药耐药（multidrug resistance，MDR）。 MDR 是临床化疗效果不佳的主要原因[2]，也是困扰肿瘤治疗的一大难题。 目前，国内口腔癌研究领域的舌鳞癌多药耐药细胞株较为稀有，严重制约了口腔癌多药耐药机制研究。 在前期研究中，我们以舌鳞癌细胞株OSC-19 为亲本，采用递增CDDP 浓度的方法，诱导制备了耐CDDP 的细胞株OSC-19/CDDP[3]，但其是否具有多药耐药性，尚需实验证实。

近年来的研究发现，miRNA 在肿瘤的发生、发展及耐药等过程中发挥重要的调控作用，仅在人舌癌细胞中就先后发现有miRNA-23a （miR-23a）[4]、miR-21[5]及miR-485[6]等近10 个miRNA 可靶向各自的靶基因调控耐药。 但与人肺癌、乳腺癌细胞等中均有近10 个可调控耐药的miRNA 相比，未被发现的miRNA 及其靶基因还有很多。 本研究通过对比OSC-19/CDDP 细胞株与其亲本OSC-19 中差异表达的miRNA， 期望找到更多调控舌癌多药耐药的miRNA， 并为探讨这些miRNA 调控舌癌多药耐药机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

OSC-19 细胞株： 购买于中国科学院上海细胞库，来源于61 岁亚洲男性人舌鳞癌组织，呈上皮样贴壁生长。 OSC-19/CDDP 细胞株：由本课题组采用浓度逐步递增CDDP 不间断方法诱导制备[3]。 试剂：胎牛血清（Gibco 公司，美国），青霉素和链霉素（华北制药公司， 中国），DMEM 高糖培养基 （Gibco 公司，美国），胰蛋白酶（Gibco 公司，美国），CCK-8 试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司)，细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司），RT-PCR 试剂盒（Takara 公司，日本），细胞总RNA 提取试剂盒（宝生物工程有限公司，日本），反转录试剂盒(Thermo 公司，美国)。药品：CDDP （武汉大华伟业医药化工有限公司，批号: 20160113），PTX（海南卓泰制药有限公司，批号:20161206），5-Fu （上海旭东海普药业有限公司，批号: 20161107），注射用PYM（吉林敖东集团延吉股份有限公司，批号：20160512）。 仪器：倒置相差显微镜（奥林巴斯公司，日本），CO2细胞培养箱（Thermo公司，德国），RT-PCR 荧光检测仪（Applied Biosystem 公司，美国）。 其他：Agilent miRNA 微流体芯片（上海康成生物工程有限公司）。

1.2 CCK-8 法检测OSC-19/CDDP 细胞耐药性

将处于对数生长期的OSC-19 和OSC-19/CDDP细胞以6×103个/孔的数量接种到96 孔板中， 每孔含100 μL DMEM，混合均匀后，常规条件下培养24 h，使细胞贴壁。 弃去每孔上清液，设置空白对照组: 不加细胞仅含培养液； 阴性对照组: 不加药物仅加细胞； 实验组: 加入药物CDDP、PTX、5-FU、PYM。按照质量浓度梯度给予100 μL 药物培养液， 每一质量浓度平行5 个复孔作为实验组。 另设置5 孔仅加入细胞和培养液的阴性对照组及5 孔没有加入细胞的空白对照组。 培养48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 及90 μL 不含胎牛血清的培养液，37℃下孵育1 h， 酶标仪测450 nm 处的吸光度值。 按公式1计算细胞存活率，并用GraphPad Prism 5 软件拟合量效关系，求半数抑制浓度值（IC50）后按公式2 计算耐药指数（resistance index，RI）。

1.3 RT-PCR 检测OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞的多药耐药基因1（MDR1）的表达

对数生长期收集2 组细胞， 分别提取总RNA，测定RNA 浓度，cDNA 试剂盒合成扩增细胞cDNA。以GAPDH作为内参，按照Takara 试剂盒说明书设计各组细胞反应体系及反应条件。 实验重复3 次以上，引物由Takara 公司合成。各基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.4 miRNA 微阵列芯片筛选

待OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞融合达到85%时， 使用细胞裂解液提取RNA 行miRNA 微阵列芯片检测。

1.5 RT-PCR 验证miRNA 微阵列芯片的结果

按照Takara RT-PCR 试剂盒产品使用说明书，对由OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞所提取的RNA进行反转录反应，并用RT-PCR 仪进行检测。 miRNAs RT-PCR 引物在广州市锐博生物科技有限公司定制。

1.6 统计学分析

实验数据采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，实验结果以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验分析，检验水平为α=0.05。

2 结果

2.1 OSC-19/CDDP 细胞耐药性检测

OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞在半数致死量浓度的CDDP、PTX、5-FU、PYM 作用后， 细胞形态见图1。 经CCK-8 法检测及GraphPad Prism 5 软件拟合量效关系，得出OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞对CDDP 的半数抑制浓度（IC50） 分别为4.55 μg/mL 及79.06 μg/mL，耐药指数(RI)为16.70（表2）。 OSC-19/CDDP 细胞对PTX、5-Fu 和PYM 产生明显耐药性，耐药指数分别为7.93、5.31 和3.01。 说明经低浓度持续增量方式诱导形成的人舌鳞癌耐药细胞株OSC-19/CDDP 能产生显著的耐药性，并对其他化疗药物产生交叉耐药性。

表2 抗肿瘤药物对于OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞的半数抑制浓度及耐药指数Tabel 2 The resistance index and median inhibitory concentration of antitumor drug to OSC-19 and OSC-19/CDDP

2.2 OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞MDR1 基因表达情况

由图2 可以观察到，OSC-19 和OSC-19/CDDP中MDR1基因信使RNA（mRNA）的表达变化。 RTPCR 结 果 采 用2-ΔΔCT方 法 分 析，OSC-19/CDDP 细 胞中MDR1mRNA 的相对表达量是OSC-19 细胞的（15.23±1.37）倍（P＜0.05）。

图1 半数抑制浓度CDDP、PTX、5-FU、PYM 作用下的OSC-19 及OSC-19/CDDP 细胞形态（×40）Figure 1 Morphology of the OSC-19 and OSC-19/CDDP cells under the LD50 concentration of CDDP，PTX，5-FU，PYM respectively（×40）

图2 OSC-19 与OSC-19/CDDP 细胞MDR1 的mRNA 表达情况Figure 2 The MDR1 gene expression level of OSC-19 and OSC-19/CDDP

2.3 微阵列芯片结果

通过对体外培养的OSC-19/CDDP 细胞及其亲本（OSC-19 细胞） 进行miRNA 芯片筛查， 发现了OSC-19/CDDP 细胞与其亲本有264 个miRNAs 表达存在差异，其中29 个miRNAs 的差异≥10 倍（17 个miRNAs 表达量增加超过10 倍，12 个miRNAs 表达量降低超过10 倍）。 我们选择了5 个miRNAs 进行RT-PCR 检测（表3），并对芯片结果进行验证，RTPCR 结果与芯片结果基本一致，证明了芯片筛查结果的可靠性及可重复性（图3）。

表3 微阵列芯片筛查差异表达的miRNAsTable 3 The miRNAs differentially expressed in micro-arraychip

图3 OSC-19/CDDP 及OSC-19 细胞中miRNAs 的表达水平Figure 3 The results of miRNAs expression level of cell of OSC-19/CDDP and OSC-19

3 讨论

肿瘤多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞对某一抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对其他结构和作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。 转运蛋白介导药物摄取能力减弱或药物外排增加是MDR 产生机制之一。 物质从细胞内排出主要依赖于细胞膜上的一组腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）依赖的药物泵，即ABC（ATP-binding cassette）转运子家族。 作为ABC 超家族成员之一的糖蛋白(P-gP) 及其编码基因MDR1是测细胞耐药性形成的标志性蛋白[7]。在本研究中，通过RT-PCR 检测发现OSC-19/CDDP 多药耐药株中MDR1表达显著高于其亲代细胞。 同时，3 种不同种类、作用机制各异的药物（PTX、5-Fu 和PYM）对OSC-19/CDDP 细胞的耐药指数， 也证明了该细胞株具有多药耐药的特性。

大量研究证实，miRNAs 不仅可调控肿瘤的发生、发展，还可调控耐药性的发生和发展，但miRNA介导的耐药具有多样性和复杂性：1 个miRNA 可以同时调控2 个或2 个以上的靶基因, 而1 个靶基因又可能受多个miRNA 的调控。 例如，同样是通过转录后负调控ABC 转运蛋白使肿瘤细胞产生CDDP耐 药， miR-200c[8]、miR-451[9]和miR-186[10]等 分 别 在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌中显示了类似的功能。 又如，miR-27a 可以在乳腺癌中调控CDDP 耐药[11]，在卵巢癌中调控PTX 耐药[12]，在肝癌中调控多药耐药[13]。这些研究说明miRNA 在调控不同药物诱导的不同组织来源细胞耐药时，既有组织特异性，也有一定的共性。 而在人舌癌细胞的研究中，已证实参与耐药调控的miRNAs 仅仅不足10 个，仍有大量的miRNAs 尚待挖掘。 本研究中，通过miRNA 微阵列芯片检测发现，在OSC-19/CDDP 细胞与其亲本中有264 个miRNAs 的表达存在差异，其中有17 个miRNAs 表达量增加超过10 倍，12 个miRNAs 表达量降低超过10 倍。 靶基因预测软件的结果显示，这些差异显著的miRNAs 的靶基因包括MDR1、 核苷酸切除修复交叉互补基因1 （ERCC1）、Bcl-2基因等，均可调控相应的蛋白表达，通过降低细胞内药物浓度、增强DNA 的修复能力、调控细胞凋亡等途径导致耐药现象的产生。 但可调控舌癌多药耐药的miRNAs 数目众多，其靶基因的功能较复杂，要在众多miRNAs 及其靶基因中找到导致舌癌细胞多药耐药的关键机制，尚需进一步研究。

综上所述，人舌鳞癌耐药细胞株OSC-19/CDDP具有多药耐药的生物学特性，可作为舌鳞癌的CDDP 耐药机制及多药耐药机制研究的理想细胞模型， 细胞中显著差异表达的miRNAs 可能在舌鳞癌耐药的发生、发展中发挥重要作用。