乳酸菌在肠道内黏附定殖的研究进展

费 苏，夏永军，艾连中，王光强

上海理工大学医疗器械与食品学院， 上海食品微生物工程技术研究中心

乳酸菌在动物胃肠道内是一种被普遍认可的优势菌。随着目前动物生长及疾病预防和治疗过程中乳酸菌的大量使用，乳酸菌在肠道定殖方面，有着巨大的推广和应用价值[1]。因此其研究价值也日益突出。

黏附定殖是评价乳酸菌在动物肠道内发挥益生作用的重要指标之一。乳酸菌通过黏附作用定殖于肠道黏液层与其上皮细胞，增强肠道黏膜的防御功能，促进自身菌群定殖[2], 调节宿主免疫系统[3,4]。

乳酸菌的定殖效果易受多种因素影响，因此，了解乳酸菌黏附定殖的相关因子，研究其在肠道内定殖的生理效应，分析各类影响因子对其黏附定殖的作用，对深入发挥乳酸菌在肠道内定殖的益生性能有所帮助。

1 黏附相关的分子基础研究

1.1 乳酸菌表面黏附因子

乳酸菌表面有单层表面蛋白(s-层蛋白)、脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(WPG)等与黏附相关的因子(表1)，都参与了乳酸菌的定殖过程。

1.1.1s-层蛋白

乳酸菌表面包括单一蛋白和糖基化或磷酸化的蛋白，具有相当规则的晶体排列形状，附着于乳酸菌的表面维持细胞的形态。s-层蛋白是排列有序、结构对称且稳定的单体晶体，可以提供外来酶的结合结构、还能够附着于宿主肠道的上皮细胞[5]。为了进一步了解s-层蛋白的黏附作用，去除或破坏s-层蛋白，再评估乳酸菌在肠道上皮细胞的黏附作用，细菌细胞的黏附作用会明显降低，在干酪乳杆菌J5 (L.caseiJ5)，鼠李糖乳杆菌F0533 (L.rhamnosusF0533)，鼠李糖乳杆菌IN4125 (L.rhamnosusIN4125)，副干酪乳杆菌M7 (L.paracaseiM7) 和干酪乳杆菌G15 (L.caseiG15 ) 去除s-层蛋白的情况下，黏附性分别降低了90%、44%、91%、92%和89%[6]。这表明，s-层蛋白在乳酸菌定殖过程中起着至关重要的作用。 已有研究表明，s-层蛋白具有高含量的疏水性氨基酸和较高的等电点(PI值为9.35～10.4)，这一特征在乳酸杆菌中普遍存在[7,8]。疏水性氨基酸有利于细菌细胞的自我凝集，在肠上皮细胞形成凝集状态细菌，能够有效阻止有害菌的定植与繁殖[9,10]。

1.1.2脂磷壁酸

脂磷壁酸(LTA)与壁磷壁酸(WTA)统称为磷壁酸，是乳酸菌细胞壁的重要组成部分。其中脂磷壁酸是磷壁酸通过共价键作用结合在细胞膜上形成的。LTA为乳酸菌细胞表面的疏水性也作出了贡献，促进乳酸菌的非特异性黏附[11]。LTA低等电点的特性，使乳酸菌表面的负电荷较多，产生静电引力，使其黏附于肠上皮细胞。Granato[12]等发现从约氏乳杆菌La1(LactobacillusjohnsoniiLa1)中提取的LTA确定为细胞的黏附因子，能够抑制致病菌对Caco-2细胞的黏附作用。

1.1.3完整肽聚糖(WPG)与多糖(PS)

胞外多糖由乳酸菌分泌，化学结构十分复杂，与肽聚糖组成的完整肽聚糖，保持细胞壁的完整结构[13]。胞外多糖的存在可以阻止致病菌的黏附因子发挥作用，阻碍致病菌凝集，从而达到抑制其他细胞定殖的目的[14]。这足以说明，胞外多糖在乳酸菌和致病菌的定殖竞争过程中，起着不可忽视的调节作用。LEBEER[15]等发现在肠道内鼠李糖乳杆菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)产生的胞外多糖能为机体的先天免疫形成保护屏障，使其能在肠道内黏附。邓一平[16]等研究双歧杆菌及表面分子脂磷壁酸 (Lipoteichoic acid, LTA)、完整肽聚糖 (Whole peptidoglycan WPG)、多糖 (Polysaccharide, PS)对猪胃黏膜糖蛋白的黏附作用，结果表明 LTA、WPG的粘附作用明显, PS粘附作用很弱。粘附随着菌液浓度的增高而增强。

1.2 黏附受体及特异性

乳酸菌在肠道内黏附定殖一般分为两个阶段，首先是菌体聚集吸附在肠上皮细胞表面，是物理层面的吸附作用，是一类可逆的过程，称为非特异性结合。后者是乳酸菌与肠上皮细胞之间的特异性结合，涉及黏附因子及宿主细胞的黏附受体。定殖过程中黏附因子和黏附受体的结合具有特异性，即不同的黏附受体只接受特定的黏附因子，只有两者结合，黏附才算完成，而这一部分主要依赖表面蛋白[17]。

研究表明，菌体表面及肠道上皮细胞的表面均有一层黏液，厚度分别为110 μm和550 μm左右。该黏液层是菌体与肠体最先接触的部分[18]。在回肠切开术所得的糖蛋白的实验中[19]，测定益生菌潜在的黏附性，结果表明益生菌未能明显降解肠黏液，黏液中的糖蛋白可作为黏附受体进行进一步的研究。在利用嗜酸乳杆菌探究鲤鱼、草鸡、新西兰兔及昆明鼠肠道黏液中能与菌体表面蛋白发生作用的黏液蛋白的研究中[20]，新西兰兔和昆明鼠肠黏液中蛋白相对分子量分别为35 000和55 000为菌体s-层蛋白的黏附受体。而鲤鱼及草鸡肠道黏液中蛋白与s-层蛋白不存在特异性相互作用，说明黏附受体蛋白随物种不同而产生变化。

表1 乳酸菌中与黏附相关的黏附因子

2 常用黏附能力评估模型

2.1 体外细胞黏附模型

该模型是目前使用最为广泛的一种评价手段。通过肠上皮细胞的体外培养，测定乳酸菌的黏附能力。具有便捷、快速等优势，主要以CaCo-2、HT-29和IPEC-J2等肠上皮细胞为主[21-25]。在筛选乳制品丙酸乳杆菌黏附特性的研究中，嗜酸乳杆菌MJLA1和乳酸双歧杆菌BDBB2对C2BBe1细胞的黏附能力与CaCo-2细胞相似[26]。LAPARRA[27]等评估肠道菌对肠上皮细胞体外模型的黏附能力，实验表明肠道中的益生菌如鼠李糖乳杆菌GG(LactobacillusrhamnosusGG) 和动物双歧杆菌乳酸亚种Bb12(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBb12) 、潜在的致病菌大肠杆菌(E.coli) 和单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes) 等对HT29-MTX及CaCo-2都体现了明显的黏附。GAGNON[28]等采用CaCo-2 细胞黏附模型筛选出了能抑制肠出血性大肠杆菌的人源性双歧杆菌。体外细胞黏附模型虽然可以直观得出菌体的黏附情况，但与动物肠道环境相差较大，肠上皮细胞的黏液层作用不能体现，因此还需要其他评估模型进行协助研究。

2.2 黏液蛋白黏附模型

乳酸菌在动物肠道内，首先与肠上皮细胞的黏液层接触，实现黏附。因此宿主的肠上皮细胞表面的黏液蛋白也可作为黏附模型基础，反应乳酸菌在动物肠道内的黏附能力。

在早期的相关研究中，KIRJAVAINEN等[29]利用人类粪便及肠道，获取了肠黏液蛋白，并以此建立了黏液蛋白黏附模型，为后续研究提供有力参考。CHATTERJEE[30]等人采用了体外黏液蛋白黏附模型探索发酵乳杆菌表面的结合蛋白(MucBP)及其对病原菌黏附抑制作用。在实际运用中，动物肠道黏液蛋白也被用于黏附模型，并能较好的反应乳酸菌黏附情况以及其对致病菌的抑制作用[31,32]。该模型的黏液蛋白由宿主提供，可以有效的证实菌体在该类型是否黏附，但也存在不能完全反应宿主肠道环境的局限性。

3 黏附的影响因素

3.1 pH

现有的实验结果表明，乳酸菌黏附于肠上皮细胞，就必须适应肠道不同部位的pH值的影响。乳酸菌无论对CaCo-2细胞还是对粘液的黏附，都存在pH依赖性[33]。例如， GRANATO D[34]等人利用重组La1 Ef-Tu蛋白，确定约氏乳酸杆菌NCC533(LactobacillusjohnsoniiNCC533)与肠细胞和粘蛋白的结合是依赖于酸碱度的。GREENE[35]的研究显示，低pH对CaCo-2细胞自身产生影响，并显著提升乳酸杆菌对CaCo-2细胞的黏附能力。在探究青春型双歧杆菌对大鼠肠上皮细胞株IEC-6黏附的相关因素的研究中[36]，结果显示，菌体黏附能力随着环境pH的降低而增强，当pH由7.4下降至4.0时，双歧杆菌黏附数也由最初的298±27升高至713±44。这表明酸性环境下，乳酸菌能够更好地黏附定殖。

3.2 表面疏水性

乳酸菌的表面蛋白具有一定的疏水性，在黏附过程中起着重要的作用。在VADILLO-RODRGUEZ[37]的研究中，嗜酸乳杆菌ATCC4356(L.acidophilusATCC4356)和干酪乳杆菌ATCC393(L.caseiATCC393)的疏水性与其黏附能力具有相关性，但也受黏附环境的离子强度影响。SHAKIROVA[38]在研究益生性乳酸双歧杆菌Bb12 (BifidobacteriumlactisBb12) 和嗜酸乳杆菌La5 (LactobacillusacidophilusLa5)的表面疏水性时发现，疏水性可作为菌体表面特性，可预测益生性乳酸菌对环境的耐受力，反应其黏附特性。刘东方等人[39]的研究显示，菌株LV108、N4和XJH301的表面疏水性较高，分别为54%、47%、44%，对应的黏附菌体数均超过14个/细胞，与同期其他菌株相比，黏附数明显升高，这表明高黏附性的乳酸菌其表面疏水性明显高于其他菌株。

3.3 钙离子浓度

目前已有的研究成果表明，钙离子浓度能够影响乳酸菌对肠上皮细胞的黏附过程。蒋建军等[40]在探究影响乳酸菌肠道定殖的不同因素时，表明当Ca2+浓度为2 mmol /L时，乳酸菌在猪肠上皮细胞中定殖效果最佳。叶桂安[41]利用钙荧光探针法，比较益生菌双歧杆菌及致病性大肠杆菌对体外肠上皮细胞Lovo细胞株黏附时，Ca2+信号传递机制的差异性。结果表明双歧杆菌黏附导致的Lovo细胞内Ca2+浓度梯度升高与时间呈正相关，这一结果是因为细胞外的Ca2+内流，可作为益生菌与肠上皮细胞良好共生的基础。通过向缺乏钙离子的乳酸菌中添加钙离子，观察其黏附功能的改变。结果显示，植物乳杆菌Q47 (L.plantarumQ47 )、约氏乳杆菌NCC 533 (L.johnsoniiNCC 533)和罗伊氏乳杆菌DSM 12246 (L.reuteriDSM 12246) 等黏附能力明显提升[42]。

4 结 语

乳酸菌的黏附是实现其在肠道定殖的基础，也是评价该乳酸菌能否成为优势菌、充分发挥益生菌功能的关键。乳酸菌在肠上皮细胞的定殖黏附机制，与乳酸菌自身条件、肠道环境等因素存在复杂关联。目前已有的体外黏附评估模型可以很好的促进定殖黏附方面的研究深入，我们可依据黏附机制，通过物理化学等方式改善肠道环境促进乳酸菌的定殖黏附，为促进动物肠道微生态健康、改善机体机能提供研究基础。