UPLC-MS 法测定烤后烟叶中的5 种游离态甾醇

郭乐乐，张晓平，刘 芳，席高磊，张明月，武志勇，赵铭钦*

1. 河南农业大学烟草学院，郑州市金水区文化路95 号 450002

2. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州经济技术开发区第三大街8 号 450000

植物甾醇（Phytosterol）是一类天然的植物活性物质，广泛存在于各种植物油、种子和坚果中，也存在于部分蔬菜水果中[1]。植物甾醇的化学结构与胆固醇类似，均含有氢化程度不同的1,2-环戊烷并菲甾核，归属于萜类天然产物[2-5]；其C-3位连有羟基，多数甾醇的C-5 位有双键，C-17 位上连有由8～10 个碳原子构成的侧链。烟草中的甾醇类主要有豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和胆甾醇[1]，霉变的烟叶中还可能含有麦角甾醇[6]，这几种甾醇的区别在于支链大小和双键数目不同，其化学结构如图1 所示。甾醇参加光合作用、生殖和免疫过程，某些甾醇还起植物激素的作用[6-7]。植物甾醇经生物转化可形成医药中间体雄甾-4-烯-3,17-二酮（4-Androstene-3,17-dione，AD）和雄甾-1,4- 二 烯-3,17- 二 酮（Androst-1,4-diene-3,17-dione，ADD），ADD 是合成甾体药物的重要原料，且生产工艺路线短、收率高，是我国甾体药物目前所采用的主要原料薯蓣皂素的优良替代品。

研究表明，烟草中甾醇通过高温裂解后可产生致癌物质——稠环芳烃，以苯并芘最为典型。Lam 等[8]和Badger 等[9]研究表明，豆甾醇在热解过程中经过一系列单分子反应可生成菲、蒽等稠环芳烃。赵伟等[10]研究了豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇以及麦角甾醇的热裂解及其与主流烟气中苯并[a]芘（B[a]P）释放量的关系，结果表明，这5 种甾醇热裂解均易产生稠环芳烃，卷烟中甾醇的添加量与主流烟气中B[a]P 释放量明显正相关，其中豆甾醇对B[a]P 释放量的贡献最为显著。

烟草中的甾醇类化合物不仅对烟草感官品质产生负面影响，也是烟气中B[a]P 等有害物质的重要前体物[11]。对烟草及其制品中的甾醇进行定量分析，对促进卷烟降焦减害研究具有重要意义。传统测定植物甾醇的方法如重量法、比色法及酶法等，仅能测定甾醇总量，不能实现对某一甾醇的定性和定量分析；近年报道的方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法[12]（HPLC）、气相色谱法[13]（GC）和气相色谱-质谱法[14]（GC-MS）等。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测灵敏度高、选择性好，是非挥发性成分定性、定量测定的有效手段，该技术也广泛用于植物甾醇分析[15-21]。在综合考虑各文献报道方法和行业标准方法的基础上，本研究中采用UPLC-MS 方法，系统研究了国内不同类型、不同品种、不同产地及不同部位烤后烟叶中5 种游离态甾醇的质量分数及分布规律，旨在为卷烟企业卷烟配方调控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟叶样品为河南省驻马店、三门峡、南阳、平顶山、许昌、洛阳，四川省凉山、攀枝花，贵州省贵阳，云南省昆明，湖南省邵阳，江西省抚州2018 年产的初烤烟叶；四川省德阳和海南省五指山生产的雪茄烟；吉林省吉林生产的晒红烟、晒黄烟。将烟叶抽去主脉放入烘箱中65 ℃烘烤至质量恒定，磨碎成烟末，过560 μm（32 目）筛。

豆 甾 醇（Stigmasterol，≥98%）、β- 谷 甾 醇（β-Sitosterol，≥98%）、菜油甾醇（Campasterol，≥98%）、胆甾醇（Cholesterol，≥96%）、麦角甾醇（Ergosterol，≥95%）（博美生物科技有限公司）；6-酮胆甾烷醇（6-Ketocholestanol，加拿大Toronto Research Chemicals 公司）；甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司）；水为超纯水。

LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Triple TOF 5600+型三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；BSA224S 电子天平（感量0.000 1 g，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Thermo Scientific Barnstead Pacific T Ⅱ级纯水仪（美国Thermo Scientific 公司）；SB25-12 DTD 超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线制作

游离态甾醇的标准曲线制作方法参照文献[22]：采用6-酮胆甾烷醇作为内标物配制成内标工作溶液。配制豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇、麦角甾醇标准储备液、一级混合标准溶液、标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理和分析

烟草中游离态甾醇的分析方法参照文献[22]：称取0.2 g 烟末试样（精确至0.000 1 g）于100 mL 具塞锥形瓶中，准确加入40.0 mL 萃取溶液，振荡萃取60 min 后，取适量萃取液，过0.22 μm有机滤膜，将滤液转移至色谱瓶中，进行UPLC-MS 分析。分析条件：

色谱柱：Shim-pack XR-ODS Ⅱ毛细管柱（100 mm×2 mm，2.2 μm）；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；流动相A：去离子水；流动相B：甲醇。离子源：大气压化学电离源（APCI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；离子对的驻留监测时间（dwell time）：96 ms；辅助气Gas1 压力：55 Pa；气帘气（CUR）压力：35 Pa；辅助气Gas2 压力：55 Pa；碰撞能量（CE）：40 eV；梯度洗脱条件如表1 所示。

表1 液相色谱梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions for liquid chromatography

2 结果与讨论

2.1 工作曲线、检出限

由低浓度到高浓度依次进行UPLC-MS 分析，制作工作曲线得线性回归方程，所有游离态甾醇工作曲线的R2均大于0.999，说明工作曲线的线性良好。将最低浓度的标准工作溶液连续进样10次，计算标准偏差，以3 倍标准偏差计算得检出限在0.13～1.36 g/mL 之间（表2）。

表2 游离态甾醇的标准工作曲线和检出限Tab.2 Calibration curves, correlation coefficients,limits of detection of free sterols

2.2 回收率和精密度

称取1 g 选定的烟叶样品，分别加入1 mL 高、中、低3 种不同浓度的游离态甾醇标准溶液，其中，豆甾醇浓度为200、400、600 μg/mL，β-谷甾醇和菜油甾醇浓度均为100、200、400 μg/mL，胆甾醇浓度为10、20、40 μg/mL，麦角甾醇浓度为5、10、20 μg/mL。每个水平重复5 次，测定回收率和相对标准偏差（RSD），表3 中结果表明，5 种甾醇的加标回收率范围为94.16%～103.18%，RSD 范围为1.04%～3.75%。说明本方法准确度高、重复性好。

2.3 烟叶中游离态甾醇的质量分数

47 个2018 年我国部分烟区生产的烟叶样品中游离态甾醇质量分数测定结果的平均值（n=3）见表4。在所研究的烟样中，游离态甾醇的总质量分数在362.5～1 008.6 μg/g 之间，其中烤烟、雪茄烟、晒烟中游离态甾醇的总质量分数分别为362.5～806.2、501.5～1 008.6、761.1～992.9 μg/g。豆甾醇质量分数最高，其次是β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇；雪茄烟和晒烟在调制过程中会产生少量霉变，因此霉变烟叶中还含有少量麦角甾醇。结果表明，豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇和麦角甾醇的质量分数范围分别为145.5～457.1、86.8～302.8、101.9～295.8、13.8～72.1 和0～56.2 μg/g。

表3 游离态甾醇的回收率和精密度Tab.3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of free sterols

表3（续）

表4 烟草样品中5 种游离态甾醇的质量分数Tab.4 Contents of five free sterols in tobacco samples （μg·g-1）

表4（续） （μg·g-1）

2.3.1 不同类型烟叶游离态甾醇的质量分数

烤烟、雪茄烟和晒烟3 种类型烟叶游离态甾醇质量分数的结果见图2。可知，烤烟及晒烟各游离态甾醇质量分数从大到小依次为豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇。雪茄烟各游离态甾醇质量分数从大到小依次为豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、胆甾醇。可见，不同类型烟叶中豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇的质量分数存在差异。

2.3.2 不同品种烟叶游离态甾醇的质量分数河南地区的贵烟2 号、豫烟6 号、云烟87、秦烟96、辽烟20、NC71 六个烤烟品种中部烟叶游离态甾醇质量分数的结果见图3。可知，不同品种烟叶游离态甾醇质量分数存在一定差异。贵烟2 号、云烟87、NC71 品种烤烟游离态甾醇质量分数变化顺序是豆甾醇＞菜油甾醇＞β-谷甾醇＞胆甾醇，其余品种烟叶游离态甾醇变化顺序是豆甾醇＞β-谷甾醇＞菜油甾醇＞胆甾醇。说明烟叶品种不同，游离态甾醇的质量分数存在差异。

图2 不同类型烟叶样品中游离态甾醇质量分数Fig.2 Contents of free sterols in different type tobacco samples

图3 不同品种烟叶中游离态甾醇的质量分数Fig.3 Contents of free sterols in tobacco leaves of different varieties

2.3.3 不同产地烟叶中游离态甾醇的质量分数

四川凉山、攀枝花，以及河南驻马店、贵州贵阳、江西抚州、湖南邵阳6 个产地的云烟87 中部烟叶的游离态甾醇质量分数的结果见图4。可知，各产地游离态甾醇质量分数存在差异，即驻马店、贵阳、抚州3 个产地烟叶中菜油甾醇质量分数高于β-谷甾醇质量分数，攀枝花产地烟叶中β-谷甾醇质量分数高于豆甾醇质量分数。6 个产地烟叶品种相同。可见产地对烟叶5 种游离态甾醇的质量分数有影响。

图4 不同产地烟叶中游离态甾醇的质量分数Fig.4 Contents of free sterols in tobacco leaves from different planting areas

2.3.4 不同部位烟叶游离态甾醇的质量分数

烤烟、雪茄烟和晒烟的上部烟、中部烟和下部烟样品游离态甾醇质量分数的结果分别见图5、图6 和图7。可知，不同部位烟叶游离态甾醇质量分数存在差异，烤烟和晒烟3 个部位烟叶游离态甾醇的分布是豆甾醇＞β-谷甾醇＞菜油甾醇＞胆甾醇；而雪茄烟上部和中部烟叶游离态甾醇的分布是豆甾醇＞菜油甾醇＞β-谷甾醇＞胆甾醇，雪茄烟下部烟叶游离态甾醇的分布是豆甾醇＞β-谷甾醇＞菜油甾醇＞胆甾醇。

图5 烤烟上部、中部和下部烟叶游离态甾醇的质量分数Fig.5 Contents of free sterols in upper, middle and bottom leaves of flue-cured tobacco

图6 雪茄烟上部、中部和下部烟叶游离态甾醇的质量分数Fig.6 Contents of free sterols in upper, middle and bottom leaves of cigar tobacco

图7 晒烟上部、中部和下部烟叶游离态甾醇的质量分数Fig.7 Contents of free sterols in upper, middle and bottom leaves of sun-cured tobacco

3 结论

①不同类型、不同品种、不同产地、不同部位的2018 年我国部分烟区生产的烟草样品中游离态甾醇的质量分数分布情况呈现一定的趋势：豆甾醇质量分数最高，其次是β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇和麦角甾醇；②烤烟、晒烟的β-谷甾醇质量分数大于菜油甾醇，而雪茄烟中菜油甾醇质量分数大于β-谷甾醇；不同品种、部位和产地的烟叶中豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、胆甾醇、麦角甾醇的质量分数不同，烤烟、雪茄烟、晒烟游离态甾醇的总质量分数也存在差异。