一种新型大鼠高脂血症急性胰腺炎模型的构建和评价

任瑞宇，陈瑶，周慧琴，丁永锴，周瑜，陈辰，王卫星

（武汉大学人民医院 肝胆外科/消化系统疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是临床常见消化系统疾病，发病率逐年升高，主要因多种因素引发胰腺腺泡细胞内酶原异常激活而导致胰腺局部的自身消化[1-4]。若病情进展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），可导致多脏器功能障碍以及全身炎症反应综合征，病死率较高[5-7]。目前胆石症仍然是AP的主要病因[8-9]，其次是酒精滥用[10-11]。随着我国经济发展和人们生活水平的提升，高脂血症的发病率也逐年上升，目前我国成人各类血脂异常的总患病率高达18.6%[12]。目前研究认为高脂血症是导致AP的独立致病因素，有学者[13-15]认为高脂血症急性胰腺炎（hypertriglyceridemia acute pancreatitis，HTGAP）有超越酒精性AP成为第二大致病因素的趋势。因此，HTG-AP也逐渐成为大家研究的热点领域。目前HTG-AP研究较多集中在临床特点分析，基础研究较少。主要原因是动物模型的构建方法尚不统一，制备模型有一定困难。因此需要建立一种稳定可靠的动物模型，为该领域的研究奠定基础。poloxamer 407（P-407）是一种广泛应用于诱导高脂血症的化学物质[16-17]，精氨酸是成熟的诱导AP模型的药物[18]。本研究拟联合应用P-407和精氨酸，建立一种新型的HTG-AP动物模型，并评价其模型效果。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

P-407和L-精氨酸均购于美国Sigma公司，大鼠麻醉药物异氟烷由武汉大学人民医院实验动物中心提供（购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。10% P-407采用无菌生理盐水溶解4 ℃过夜备用。20% L-精氨酸需造模前配置，无菌生理盐水溶解（pH7.0）。

1.2 动物分组与模型制备

SPF级雄性SD大鼠72只、体质量（200±20）g（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于武汉大学人民医院实验动物中心）。按随机数字表法随机分为4组：正常对照组、低P-407剂量组（0.12 g/kg）、中P-407剂量组（0.25 g/kg）和高P-407剂量组（0.50 g/kg）。正常对照组自由进食水，不做干预处理。其余3组大鼠分别腹腔注射各自剂量的P-407，每日1次，诱导高脂血症，每组分别于1、2、4周后随机各取6只大鼠，腹腔注射20% L-精氨酸（2.5 g/kg）2次（中间间隔1h）诱导胰腺炎，并于24 h后采用异氟烷麻醉状态下剖杀取材，下腔静脉采血，离心后取血清于-20 ℃保存备用用于生化指标检测；取胰头部胰腺组织，4%多聚甲醛固定24 h后，石蜡包埋用于光镜组织病理学检查备用。

1.3 指标检测

血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LIPA）均采用本院检验科全自动生化分析仪测定。胰腺组织切片，H E 染色后光镜下观察，参照本团队既往研究的基础[19]，按水肿、胰腺腺泡坏死、出血和脂肪坏死、炎症和血管周围炎性浸润等方面进行病理学评分。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 血清肝肾功能指标的变化

与正常对照组比较，各剂量P-407组各时间点血清ALT、AST、Cr和BUN均无明显改变，差异无统计学意义（均P＞0.05）（表1）。

2.2 血清TG 和TC 的变化

在低剂量组，随着P-407注射时间的延长，血清TG和TC逐渐升高，与正常对照组相应的时间点比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），但是血清TG水平未达到HTG-AP诊断标准[20-21]。中、高剂量组，血清TG和TC水平随着时间延长逐渐上升，与正常对照组相应的时间点比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；中剂量组从2周开始，高剂量组从1周开始，其血清TG均＞11.3 mmol/L，符合HTG-AP血脂标准（图1）。

表1 各组大鼠各时间点肝肾功能指标（）Table 1 Levels of liver and kidney function parameters in each group of rats at different time point ()

表1 各组大鼠各时间点肝肾功能指标（）Table 1 Levels of liver and kidney function parameters in each group of rats at different time point ()

时间 ALT（U/L） AST（U/L）Cr（μmol/L）BUN（mmol/L）正常对照组1 周 39.00±2.00 55.50±8.48 21.00±3.74 9.25±2.38 2 周 40.50±3.50 50.52±7.50 23.67±6.34 8.89±1.32 4 周 40.00±5.00 51.37±13.02 26.00±2.45 9.24±0.70 P-407 低剂量组1 周 39.20±8.77 47.00±10.42 22.50±4.72 8.83±0.98 2 周 42.20±9.79 49.08±3.56 24.75±4.71 9.53±1.28 4 周 41.60±9.09 49.00±4.97 22.75±4.32 9.27±1.41 P-407 中剂量组1 周 39.40±9.18 53.71±11.22 25.50±3.91 10.03±1.52 2 周 39.60±8.33 54.33±8.06 24.25±4.82 10.23±1.35 4 周 38.00±8.56 54.35±4.15 24.80±5.95 9.16±1.35 P-407 高剂量组1 周 41.40±11.32 52.40±8.71 22.60±6.22 9.21±1.78 2 周 39.67±11.03 54.67±7.76 27.33±6.13 10.38±0.95 4 周 38.00±10.00 46.33±7.13 24.50±4.72 10.37±1.57

图1 各组大鼠各时间点血清TG、TC 水平Figure 1 Serum levels of TG and TC in each group of rats at different time point

2.3 血清AMY 和LIPA 的变化

与正常对照组比较，各P-407剂量组各时间点大鼠的血清A M Y、L I P A 均明显升高，且随着P-407剂量增加、给药时间延长而逐渐上升，差异有统计学意义（均P＜0.05）（图2）。

图2 各组大鼠各时间点血清AMY、LIPA 水平Figure 2 Serum levels of AMY and ALT in each group of rats at different time point

2.4 胰腺组织病理学改变

在正常对照组，光镜下可见胰腺结构正常，无水肿、出血及炎症细胞浸润。P-407低剂量组开始出现腺泡水肿、轻度出血；随着P-407注射剂量的增加、给药时间延长，上述病理损伤逐渐加重，同时出现炎症细胞浸润和片状坏死（图3）。与正常对照组比较，各剂量P-407组大鼠胰腺损伤病理评分均明显升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；且病理评分随P-407剂量上升、给药时间延长而逐渐增加，差异具有统计学意义（均P＜0.05）（图4）。

图3 各组大鼠光镜下胰腺病理学改变（HE×200）Figure 3 Pathological changes of the pancreas in each group of rats under light microscope (HE ×200)

图4 各组大鼠各时间点胰腺损伤病理评分Figure 4 The pathological scores of pancreatic injuries in each group of rats at different time point

3 讨 论

随着人们饮食结构的变化，高脂血症的发病率逐渐升高，导致HTG-AP日益增多。依据最新的《中国急性胰腺炎诊治指南（2019，沈阳）》[20]，HTG-AP具有年轻化、重症化的趋势，因此逐渐成为研究的焦点。既往的基础研究中，学者们大多采用在高脂血症的基础上进一步制备AP，从而构建HTG-AP动物模型，但是对于动物的选择、模型构建的方法并不一致。主要的差异在如何建立稳定、高效、便捷的高脂血症动物模型。有研究发现某些先天性高脂血症动物例如遗传性高脂血症家兔，可以用于实验研究，但这些遗传缺陷的动物来源有限，而且其血脂升高以TC为主[21-22]，与HTG-AP时以TG升高为主[20,23]的特性并不一致，所以限制了其应用范围。另外，有学者[24-25]采用高脂血症表型的转基因小鼠作为研究对象，但是这类动物费用昂贵，而且这种基因修饰的结果可能引发不可预见的“下游”生化事件的发生，从而改变某些疾病本来的发展，因此其应用也受到限制。

目前主要采用高脂饲料喂养法来建立高脂血症动物模型。其具体方法要么采用直接喂养，即动物自由进食高脂饲料引起脂质代谢紊乱，但是动物个体进食量参差不齐，该方法不能保证喂养效果。要么采用灌胃法，将高脂饲料强行以灌胃方式于实验动物；但该方法粗暴，灌胃针可能损伤大鼠食管或者气管；另外还存在以下缺点：如每次的灌胃量受到限制；高脂饲料浓度高，不容易通过灌胃针进入食道等等。既往笔者研究团队也采用高脂乳剂灌胃法[26]，制备高脂血症模型，但是造模模型过程较为艰难，也存在上述造模过程中的缺点。因此，本研究试图寻找其他更加稳定、便捷的造模方法。

近年来，采用化学物质建立高脂血症动物模型的方法，取得了良好的效果。有学者[27]采用Triton-WR1339腹腔注射的方法制备高脂血症动物模型，但是该药物制备模型后TG水平随时间延长并不稳定，限制其应用。poloxamer是一种分子表面活性剂，其通过抑制脂蛋白脂酶和胆固醇进入细胞，导致血浆脂蛋白浓度升高，形成高脂血症。其中P-407作为制备高脂血症动物模型的药物，它的特点是经腹腔注射后血脂水平明显升高，以TG升高为主，并且可以持续维持这种高脂血症状态；同时副作用较小[28-29]。

因此本研究选择P-407作为制备高脂血症模型的药物。为了探讨其在大鼠造模过程中的剂量，本研究参考相关文献[29]设定了低、中、高3个剂量组，观察其造模效果和其对肝肾功能的影响。实验结果显示，中剂量组腹腔注射第2周、高剂量组第1周开始，可以获得稳定的高TG血症的状态，此时TG水平＞11.3 mmol/L，符合HTG-AP血脂标准。同时本研究也检测该状态下大鼠血清ALT、AST、Cr、BUN的变化，其结果与正常对照组比较差异无统计学意义，说明腹腔注射P-407没有造成肝肾功能的损害，副作用较小。这也为后续实验奠定了基础。在AP造模方面，笔者没有采用胰管注射牛磺胆酸钠法，因为该方法需开腹穿刺胰管，损伤较大。故采用成熟的、创伤更小的腹腔注射精氨酸造模的方法[30-31]。在上述构建高脂血症动物模型的基础之上，采用腹腔注射2次2.5 g/kg L-精氨酸（pH7.0）（每次间隔1 h）制备AP模型，其结果显示：注射精氨酸后，大鼠血清AMY、LIPA显著升高，光镜下可见胰腺组织出现水肿、胰腺腺泡坏死、出血、炎症细胞浸润等典型AP的表现。

综合上述结果证明：P-407联合精氨酸制备HTG-AP动物模型的方法操作简便，模型稳定，且注射P-407副作用小，可以为HTG-AP后续的相关研究奠定基础。