探讨TGFβ1、PDGF、VEGF 对特发性肺纤维化诊断及病情评估的临床意义

孙 莹 宋晓萍 孙 伟

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是间质性肺病中常见类型，因缺乏有效的治疗药物，导致了诊断后的平均生存时间不足5 年，其医疗费用昂贵，给国家、社会、家庭带来沉重的经济负担［1-3］。IPF 从早期干咳到进行性活动后呼吸困难需经历一个慢性发展的疾病过程［4］。当出现典型的影像学征象（双侧胸膜下对称的蜂窝影）、肺功能改变时，往往已经进展到中晚期［5］。

特发性肺纤维化进展的主要病理表现为肺间质中肌成纤维细胞的聚集活化后，形成细胞外基质的沉积［6-7］。新近的研究表明，Ⅱ型肺泡上皮细胞反复损伤是肌成纤维细胞聚集活化的关键环节［8］。肺泡上皮细胞损伤后通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等大量的细胞因子，过度激活多条纤维化信号通路，如TGFβ／Smad2／3、PDGF／Erk、VEGF／p-Junk 等，一方面致成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，形成细胞外基质沉积；另一方面血管内皮细胞发生肿胀，影响换气功能［9-11］。由此可见，在特发性肺纤维化病情进展过程中，TGFβ1、PDGF、VEGF 细胞因子扮演重要角色。

资料与方法

一、一般资料

选取2014 年1 月至2018 年12 月在我院住院诊断为IPF 并进行治疗的35 例患者作为观察组，18 例Ⅰ期结节病患者作为对照组。其中观察组男性22 例，女13 例，年龄47 ～70 岁，中位年龄57.76 岁。纳入标准：①入组患者存在不同程度的呼吸困难及干咳等临床表现；②诊断标准均符合美国胸科协会、欧洲呼吸协会制定的特发性肺纤维化诊断标准。排除标准：①除IPF 之外的其他间质性肺疾病、急性感染、慢性阻塞性肺疾病、恶性肿瘤及自身免疫性疾病患者；②入组患者在治疗之前均未经过糖皮质激素治疗。对照组男10 例，女8 例，年龄50～72 岁，中位年龄56.66 岁。对照组纳入标准：①入组患者经胸部CT 诊断为肺结节病（Ⅰ期）；②均存在不同程度的呼吸困难、干咳等症状。对照组排除标准：①除结节病之外的其他肉芽肿性疾病，如：肺结核、淋巴瘤等；②诊断之前有糖皮质激素治疗史；③存在肺泡灌洗液检查禁忌证。

二、检测方法

1.免疫印迹检测IPF 患者血清中细胞因子的表达：3 000×g 离心IPF 患者血液10 min，收集上清液。制备分离胶及浓缩胶后，每孔加样50 ～100 μg蛋白，计算每孔中蛋白质样品的体积，1×PBS 调整体积为15 μl，再向每个样品管中加5 μl 4×上样缓冲液，操作均在冰上进行。将制好的胶放在电泳槽中，加满电泳缓冲液，轻拔梳子，左侧第一个孔道为蛋白Marker，依次在各个孔道中加入样品。安装好系统后，4 ℃，110 V 电压下开始电泳，90 min 后开始转膜。转膜结束后PVDF 膜进行封闭，封闭结束后4 ℃孵育过夜孵育一抗；次日PBST 洗膜3 次后孵育二抗2 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min，进行显色及图像分析。

2.支气管肺泡灌洗（BALF）与血清样本留取：常规吸入麻醉后行电子纤维支气管镜检查，选择右肺中叶（B4 或B5）或左肺舌叶作为灌洗部位，注入100 ml 生理盐水后，经纱布过滤回收至离心管（回收率＞40%）。支气管镜检查结束后立即静脉采血5 ml。BALF 液于4 ℃，以离心半径8 cm，1 200 r／min 离心10 min，取上清液。将上清液注入无菌透析袋，在50%聚乙二醇溶液中进行浓缩。24 h 后加入生理盐水，样本放置-80 ℃冰箱保存。复溶1／10体积样本参照《中华医学会呼吸学分会支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范（草案）》进行实验。离心静脉血的方法同前），取上清后放置-80 ℃冰箱保存。

3.TGFβ1、PDGF、VEGF 表达水平测定：双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA，购于上海通蔚科技有限公司，生产编号为TWp628035）检测观察组和对照组患者血液及支气管肺泡灌洗液中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表达水平。标准曲线计算上述细胞因子的浓度（U／ml）。

4.肺功能测定：采用意大利MIR 米尔Ⅲ型肺功能仪，记录第1 秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%）、用力肺活量占预计值百分比（FVC%）、一氧化碳弥散量占预计值百分比（DLCO%）。

三、统计学方法

结 果

一、两组患者胸部CT 影像学比较

影像学CT 检查可见两组之间的差异，观察组可见双肺胸膜下对称的蜂窝或网格样改变，符合IPF 表现。对照组可见双侧肺门淋巴结肿大，肺部未见明显浸润影，见图1。

图1 结节病与IPF 的CT 影像学表现

二、TGFβ1、PDGF、VEGF 在特发性肺纤维化患者血清中表达上调

在IPF 患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 是否存在表达尚不清楚。本研究首次采用免疫印迹的方法检测患者血清。实验结果发现：与对照组相比，观察组患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 表达明显升高（P＜0.05），见图2。

图2 免疫印迹检测各组TGFβ1、PDGF、VEGF 的表达水平

三、TGFβ1、PDGF、VEGF 在特发性肺纤维化患者BALF 和血清中存在差异性表达

ELISA 检测两组患者的 BALF 及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 细胞因子的表达情况。结果发现IPF 患者BALF 中TGFβ1、PDGF、VEGF 细胞因子的表达水平高于对照组（P＜0.05）；IPF 患者血液中上述细胞因子的表达水平明显高于对照组（P ＜0.05）。这一实验结果提示了上述细胞因子可能参与了肺间质纤维化的进程，见表1，2。

表1 两组患者BALF 液中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表达变化

表2 两组患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表达变化

四、TGFβ1、PDGF、VEGF 细胞因子的表达水平与肺功能及血氧分压的相关性

IPF 组患者BALF 及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 细胞因子的表达与FEV1%、FVC%、DLCO%pred 呈负性相关（P＜0.05）；IPF 组患者BALF 及血清中上述细胞因子与血氧饱和度呈负性相关（P＜0.05）。这说明TGFβ1、PDGF、VEGF 的表达水平的升高可作为评估IPF 患者的诊断及病情评估，见表3。

讨 论

IPF 是间质性肺病中常见的疾病类型［12］。目前尚无有效的治疗手段阻止其进展。现今诊断IPF患者的主要检查手段为胸部CT，但当胸部CT 确诊后多数病情已进展到晚期［13］。因此如何通过无创性检查对IPF 的病情进展尽早评估是目前临床医生面临的挑战。

表3 IPF 患者TGFβ1、PDGF、VEGF 与肺功能检查及血氧分压的相关性

IPF 进展机制不明，已有的研究证实肌成纤维细胞在肺间质中的聚集活化进而产生细胞外基质沉积是IPF 病情进展的关键分子机制［14］。研究表明，肺泡上皮细胞的反复损伤后会发生异常修复，TGFβ1、PDGF、VEGF 过度分泌，上述细胞因子可过度活化多条致纤维化信号通路［9-11］。TGFβ／Smad2／3、PDGF／Erk 信号通路的活化使间质中的成纤维细胞向肌成纤维细胞活化［9-10］；VEGF／p-Junk 信号通路的活化使血管通透性增加，间质中的炎症细胞增加，影响换气功能［11］。本研究推测：TGFβ1、PDGF、VEGF 细胞因子的水平变化可作为评估IPF 病情进展的指标。目前胸部影像学是诊断IPF 的主要手段，主要表现为沿胸膜下、基底部分布为主的蜂窝影。除了影像学可作为评估病情进展之外，我们猜测TGFβ1、PDGF、VEGF 在血液中的表达可作为评估疾病进展的无创性血清标志物。为了验证最初的设想，本研究发现TGFβ1、PDGF、VEGF 在IPD 患者血清中表达水平明显上调，这也与国外的研究报道是相一致。

对IPF 患者进行肺泡灌洗液分类有助于治疗方案的选择［15］。因此本研究除采集IPF 患者血液样本外，也搜集了患者的BALF。研究结果显示IPF患者血液及BALF 液中TGFβ1、PDGF、VEGF 表达水平均明显升高。这些实验结果均说明TGFβ1、PDGF、VEGF 与IPF 患者的病情进展有密切关系。因此，本项目将上述细胞因子的表达情况与肺功能检查及血氧饱和度监测具有相关性进行了统计。

IPF 从诊断到病情评估会涉及多学科协作，如病理科、影像科、免疫风湿科等［16-17］。目前胸部CT可作为诊断IPF 的主要工具，但在疾病早期因缺乏特异性影像学表现而无法精准的评估病情［18］。虽然肺组织病理检查是确诊IPF 的金标准，但是实际可行性及可操作性非常低，临床开展十分困难，对病情的评估也缺乏一定的准确性［19］。目前评估IPF患者病情进展的主要症状为进行性呼吸困难，临床中主要依靠肺功能及血气分析［20］。 为了检测TGFβ1、PDGF、VEGF 是否与肺功能检查及血氧饱和度的相关性，本实验将ELISA 检测IPF 患者中TGFβ1、PDGF、VEGF 表达水平与肺功能及血氧饱和度的数值进行统计，以验证上述细胞因子是否可作为无创性评估IPF 病情进展的有效指标。通过对IPF 患者的BALF 液及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF与肺功能的相关性分析发现：上述细胞因子的表达水平与FEV1%、FVC%及一氧化碳弥散呈明显的负性相关。有趣的是上述细胞因子的表达水平与血氧饱和度也呈负性相关，其中以TGFβ1 最为显著。TGFβ1 目前也是公认的强烈致器官纤维化细胞因子。

本文分别从分析TGFβ1、PDGF、VEGF 表达水平与肺功能及血氧饱和度的相关性分析可看出，无论血液还是BALF 液指标均与上述细胞因子呈明显的负性相关。故本研究认为血液中上述细胞因子检测可作为诊断IPF 患者及监测病情进展的客观指标。但是本研究仍有不足之处，比如时间较短，样本病例数较少，且未对患者进行治疗前后及全程随访的动态观察，因此仍需深入研究。