Lyn 激酶介导Erk-sp1 信号通路改善慢性阻塞性肺疾病的观察分析

刘莉敏 熊 静 李玉磊 邱晶晶 张瑞芳

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常见的慢性呼吸系统疾病之一，其临床表现主要有咳嗽、咯痰、气喘、胸闷以及呼吸困难等［1-3］。COPD 的发病率和病死率均呈上升趋势，现已成为世界范围内影响健康的主要问题［4］。COPD 发病机理尚未完全阐明，COPD 后组织损伤、炎症以及氧化应激等多种过程复杂的相互作用［5-8］。而COPD 的典型危险因素是香烟烟雾，其可引起慢性气道炎症，并导致小气道异常与实质破坏，加快肺功能下降速度［3，9］。Lyn 激酶是非受体酪氨酸激酶Src 家族成员，参与调节细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、代谢与免疫反应等过程，并与多种信号途径相关联，在相同或不同细胞中起着正向或负向的调节作用［10-13］。LYN 基因参与了COPD 患者肺功能的恶化，但Lyn 激酶在COPD 中发生机制中的相关报道较少［14］。探索Lyn 激酶对COPD 发生过程中的作用及其机制，对于寻找COPD 治疗新靶点及新型药物有着重要意义。

材料与方法

一、实验材料

实验动物选择健康清洁级野生型C57BL／6j 小鼠与Lyn＋转基因C57BL／6j 小鼠，8 周龄，体质量20～28 g，购自重庆腾鑫比尔动物有限公司。10%水合氯醛与脂多糖购自美国Sigma 公司，过滤嘴香烟（焦油含量 为19 mg，尼古丁含量为1.2 mg）由南宁卷烟厂生产，酶联免疫吸附试剂盒（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）购自上海碧云天生物技术公司，RIPA裂解液与Bio-Rad 蛋白测定试剂盒购自Invitrogen公司，HE 染色试剂盒购自北京索莱宝科技公司，抗体β-actin、pErk、Erk、sp1 以及HRP 标记山羊抗兔IgG 购自英国Abcom 公司。

二、实验方法

1.动物饲养与分组：将所有小鼠分笼饲养，环境温度为20 ～25 ℃，相对湿度50%～70%，期间自由饮水与摄食。适应性饲养1 周后开始实验。将16 只野生型C57BL／6j 小鼠分为两组，每组8 只，分别标记为：WT 组，WT＋COPD 组；将16 只Lyn＋转基因C57BL／6j 小鼠也分为两组，每组8 只，分别标记为：Lyn＋组，Lyn＋＋COPD 组。WT＋COPD 组和Lyn＋＋COPD 组小鼠通过香烟熏吸加气道内注入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）方法建立COPD 模型。

2.COPD 模型制备：采用香烟烟熏联合气道内注入脂多糖的方法构建小鼠COPD 模型［15］。将小鼠放于自制有机玻璃熏烟箱内，点燃10 根香烟熏吸，2 次／d，每次30 min，连续60 d。在实验期间第10、40 d，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定于固定板上，暴露气管，在气管内快速注入100 μl LPS（1 mg／ml），旋转固定板，尽可能的使LPS 充分均匀的分布于小鼠两肺。WT 组和Lyn＋组小鼠于第10、40 d 气管内注入2 ml／kg 生理盐水，其余时间均进行正常培养，即不进行烟熏。

3.肺功能评估：造模完成24 h 后，对各组小鼠进行肺功能检测。用10%水合氯醛腹膜内麻醉小鼠。固定四肢及头部，颈部消毒，钝性逐层分离颈部皮下组织至暴露气管，将气管插管并连接到动物肺功能检测仪，记录小鼠相关肺功能指标，包括吸气阻力（Ri）、肺动态顺应性（Cdyn）及0.3 s 用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV0.3／FVC）。

4.肺泡灌洗液收集：使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠四肢及头部固定，消毒后打开胸腔暴露小鼠气管，在气管下端横纵切一小口后插入插管，成功插入后进行结扎固定，避免渗液。使用1 ml注射器吸取0.8 ml 生理盐水注入小鼠肺部进行灌洗，轻柔按摩小鼠胸前区，30 s 后缓慢抽回灌洗液，再将抽回的灌洗液缓慢注入，重复3 次，直到可见乳白色泡沫状液体表示灌洗成功，进行收集。

5.ELISA 检测：抽取小鼠动脉血，室温下静置30 min 后，以离心半径8 cm 2 000 r／min 离心20 min分离出血清。将肺支气管肺泡灌洗液（BALF）置于离心管，2 000 r／min 离心5 min，取上相液。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清和BALF 中IL-1β、IL-6、IL-10 与TNF-α 含量，所有步骤均严格按照试剂盒操作流程进行。

6.HE 染色：处死小鼠并摘取肺组织，在4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、常规石蜡包埋后，切成厚度为4 μm 的薄片。苏木精染色5 min，流水冲洗，伊红染色液染色3 min，再次流水冲洗，乙醇进行脱水后自然晾干，二甲苯透明10 min，中性树胶封片，于显微镜下观察观察组织病理形态改变并拍照。

7.Western blot：将小鼠肺组织放入匀浆器内，加入预冷的RIPA 裂解液，研磨组织至裂解液无沉淀，冰上裂解30 min，以离心半径8 cm 12 000 r／min离心5 min，获得上清液。使用Bio-Rad 蛋白测定试剂盒测定肺组织总蛋白浓度。取30 μg 总蛋白上样，通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将分离后的蛋白转移至PVDF 膜上。TBST 洗涤3 次，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后加入一抗抗体βactin（1∶2 000），pErk（1∶1 000），Erk（1∶1 000）和sp1（1∶1 000）于4 ℃孵育过夜。次日，TBST 洗膜3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）室温孵育2 h。再次使用TBST 洗涤3 次，滴加ECL 发光液进行显影，quantity one 测定条带光密度值并计算相关蛋白表达水平。

三、统计学分析

采用SPSS19.0 软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，P＜0.05为差异有显著性意义。

结 果

一、各组小鼠肺功能情况

小鼠肺功能检测结果显示，与WT 组小鼠比较，WT＋COPD 组小鼠的Ri 明显升高，Cdyn 与FEV 0.3%／FVC 均明显下降（P＜0.05）；与Lyn＋组比较，Lyn＋＋COPD 组Ri 明显升高而Cdyn 与FEV0.3%／FVC 均明显下降（P＜0.05）；与WT＋COPD 组比较，Lyn＋＋COPD 组Ri 下降而Cdyn 与FEV0.3%／FVC 有所升高（P＜0.05），见图1。

二、各组小鼠肺组织病理改变

各组小鼠肺组织HE 染色结果如图2 所示，WT组与Lyn＋组小鼠肺组织的肺泡结构清晰，间隔正常，肺泡壁完整，无明显炎细胞浸润、充血、渗出等现象。WT＋COPD 组肺组织中可见肺泡结构破坏，断裂，相邻肺泡腔相互融合成肺大疱，出现大量炎性细胞浸润。Lyn＋＋COPD 组小鼠肺组织肺泡破裂融合以及炎性细胞浸润等情况较WT＋COPD 组小鼠有所减轻。

图1 各组小鼠肺功能检测；注：与WT 组比较，*P＜0.05，与Lyn＋组比较，＃P＜0.05，与WT＋COPD 组比较，△P＜0.05

图2 各组小鼠肺组织病理改变观察（HE×200）

三、各组小鼠炎症细胞因子表达情况

各组小鼠血清中炎症细胞因子检测结果显示，与WT 组比较，WT＋COPD 组小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量均明显增加（P ＜0.05）；与Lyn＋组比较，Lyn＋＋COPD 组IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα 的含量均明显增加（P＜0.05）；而Lyn＋＋COPD 组IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量较WT＋COPD 组降低（P＜0.05），见表1。

各组小鼠BALF 中炎症细胞因子检测结果显示，与WT 组比较，WT＋COPD 组小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量均明显增加（P＜0.05）；与Lyn＋组比较，Lyn＋＋COPD 组IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα 的含量均明显增加（P＜0.05）；而与WT＋COPD 组比较，Lyn＋＋COPD 组IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量降低（P＜0.05），见表2。

四、各组小鼠肺组织Erk-sp1 相关蛋白表达情况

各组小鼠肺组织中Erk-sp1 通路蛋白表达检测结果显示，与WT 组比较，WT＋COPD 组小鼠肺组织中pErk、sp1 的蛋白水平均明显增加（P＜0.05）；与Lyn＋组比较，Lyn＋＋COPD 组pErk、sp1 的蛋白水平均明显增加（P＜0.05）；而Lyn＋＋COPD 组pErk、sp1 的蛋白水平较WT＋COPD 组降低（P＜0.05），见图3。

讨 论

COPD 是临床常见疾病之一，其主要表现为气流受限与肺功能下降，随着其发病率与病死率的不断增加，严重影响了人们的生活质量，同时也带来巨大的经济负担和精神压力［4，16］。探索COPD 的发病机制与有效治疗手段，对于提高COPD 的临床治疗效果和预后十分必要。COPD 的发展涉及多种细胞的募集，这些炎症细胞被激活后，产生并释放多种炎症介质，例如ROS、IL-6、IL-8、TNF-α 等，这些炎症介质与因子相互作用导致气道壁的受损和肺气肿的发生［17-20］。研究表明，长期吸入香烟烟雾是持续发炎的主要原因，烟雾中的氧化剂可通过直接激活相关信号通路来破坏细胞和组织，阻碍防御机制并引发炎症［7，21］。由此可见，抑制炎症反应是COPD 治疗中的重要环节。

COPD 的主要致病因素包括吸烟、有机粉尘与环境暴露［22］。本文通过香烟烟熏联合气道内注入脂多糖的方法构建COPD 小鼠模型，野生型小鼠结果与COPD 病理特征一致，而Lyn＋转基因小鼠构建COPD 后，小鼠肺泡结构破坏以及炎性细胞浸润等病变情况较野生型小鼠有所减轻。因此，推测在COPD 小鼠中，Lyn 可能扮演着一个重要角色，Lyn的高表达与COPD 病情发展密切相关。

细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是将信号从表面受体传导至细胞核的一种关键酶。Sp1 是ERK 下游重要的核转录因子，磷酸化的Sp1 稳定性和转录活性会升高，从而激活大量下游基因的表达［23］。研究表明，Erk-sp1 信号通路在肿瘤进程中起到促进作用［24-25］。C6 神经胶质瘤细胞中成纤维细胞生长因子-2 可通过Ras-Raf-Erk-sp1 信号轴上调巢蛋白的表达，靶向抑制Erk-sp1 信号通路进而抑制肿瘤的发展。报道指出，吸烟者体内Erk 的表达水平增加，而尼古丁可特异性激活Erk2 信号转导途径，Erk 表达上调会促进炎症介质（如ROS，IL-6，IL-8）的水平。这表明Erk 途径是发展COPD 的重要步骤。本文中pErk、sp1 蛋白表达水平在COPD 小鼠中明显增加。但是，Lyn＋转基因COPD 小鼠中Erk 磷酸化和sp1 表达较野生型COPD 小鼠明显下降。此外，Lyn＋转基因COPD 小鼠血清和BALF 中炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）也明显降低，表明Lyn 激酶的抗COPD 效应与Erk-sp1 途径的下调密切相关。

表1 各组小鼠血清中炎症细胞因子表达情况

表1 各组小鼠血清中炎症细胞因子表达情况

注：与WT 组比较，aP＜0.05，与Lyn＋组比较，bP＜0.05，与WT＋COPD 组比较，cP＜0.05

组 别 样本量（n） IL-1β（pg·ml-1） IL-6（pg·ml-1） IL-10（pg·ml-1） TNF-α（pg·ml-1）WT 组 8 68.78±9.89 90.56±16.56 98.86±13.44 102.34±20.89 WT＋COPD 组 8 322.34±26.60a 480.34±22.34a 470.45±23.56a 1254.78±67.90a Lyn＋组 8 67.66±22.34 92.09±18.87 96.76±17.48 108.09±19.98 Lyn＋＋COPD 组 8 160.56±21.51bc 294.32±27.67bc 290.34±19.85bc 760.09±23.88bc

表2 各组小鼠BALF 中炎症细胞因子表达情况

表2 各组小鼠BALF 中炎症细胞因子表达情况

注：与WT 组比较，aP＜0.05，与Lyn＋组比较，bP＜0.05，与WT＋COPD 组比较，cP＜0.05

组 别 样本量 IL-1β（pg·ml-1） IL-6（pg·ml-1） IL-10（pg·ml-1） TNF-α（pg·ml-1）WT 组 8 1.38±0.14 1.46±0.24 1.26±0.14 1.34±0.21 WT＋COPD 组 8 5.01±0.31a 4.32±0.38a 3.85±0.46a 7.85±1.67a Lyn＋组 8 1.26±0.23 1.39±0.19 1.27±0.20 1.24±0.08 Lyn＋＋COPD 组 8 2.56±0.24bc 2.12±0.17bc 1.96±0.25bc 4.09±0.65bc

图3 各组小鼠肺组织Erk／sp1 相关蛋白表达；注：与WT 组比较，*P＜0.05，与Lyn＋组比较，＃P＜0.05，与WT＋COPD 组比较，△P＜0.05

综上所述，本文探究了Lyn 在COPD 小鼠模型中的作用，Lyn 高表达可减轻肺组织病理及炎症程度，其机制可能与Erk-sp1 信号通路密切相关。本文为COPD 治疗提供了新的靶点。但这一过程是否有其它因子和信号通路的参与并发挥作用仍待进一步研究。