基于网络药理学方法研究丹参-葛根配伍治疗冠心病的作用机制

马 阳，王文军，黄少杰，雷 露，王 凯，封小娜，丁 一*，文爱东*

1陕西中医药大学药学院，咸阳 712046；2空军军医大学第一附属医院，西安 710032

冠心病(coronary heart disease，CHD)又称冠状动脉性心脏病，是一种由冠状动脉血流量减少导致的心肌缺血、缺氧甚至坏死进而导致的心脏疾病，亦称缺血性心脏病[1]。CHD是心血管疾病的主要形式之一，心脑血管疾病发病率和死亡率高，对人类健康和生命造成了严重的威胁[2]。目前，治疗CHD临床上常用的方法是外科治疗、西药治疗和中药治疗，较西药而言中药复方在治疗CHD上具有一定的优点，它可以从多靶点、多通路等角度对疾病进行全面的治疗，在临床上也取得了较为显著的疗效[3]。

在众多的现代研究中，丹参-葛根联合应用于多种中药复方中，即丹参葛根汤，具有抗氧化、舒张血管作用，可改善冠心病患者的脂质分布、血管功能和结构[4]。研究表明丹参葛根联用治疗冠心病心绞痛的疗效比硝酸甘油更优，不良反应更少[5]。丹参-葛根合用针对病位在血脉或经脉的瘀血阻滞，葛根促进血管平滑肌的运动，来促进血液循环；丹参可以清除出血后或者血流缓慢引起的血管内外血液瘀滞，确保血流畅通。然而，其治疗机制仍不明确。

网络药理学采用高通量组学数据分析、网络数据库检索、计算机虚拟计算等方法，通过网络分析，系统地观察药物与疾病的关系，解释了多组分药物协同作用的特点[6]。利用专业网络分析软件系统、整体地揭示药物与机体的相互作用规律及机制，网络药理学注重整体性和系统性的特点，符合中医药理论[7]。本研究通过网络药理学方法研究丹参-葛根药对治疗CHD的作用机制，为该药对的临床应用和进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验用软件及在线工具

本次研究需要使用大量的软件及在线工具，首先在中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)及Uniprot数据库进行化合物靶标预测，在DrugBank、Therapeutic Target Database (TTD)和Disgenet数据库分别进行冠心病发病机制靶标的预测，然后ChemDraw软件中绘制化合物结构式，在STRING线数据库中绘制蛋白互作网络图(PPI)，将数据导入生物学信息注释数据库(DAVID)进行京都基因与基因组(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本体(Gene ontology，GO)富集分析，安装Cytoscape软件进行分析并绘图，详细内容见表1。

表1 本次研究使用的软件及在线工具

1.2 冠心病靶点获取

以Coronary Heart Disease为关键词在TTD、DrugBank和Disgenet数据库中查询CHD的相关靶点。将检索到的蛋白名称复制到Uniprot数据库中对靶点进行校正，整理并筛除重复项。

1.3 丹参和葛根成分和靶点获取

研究以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug likeness，DL)为主的药动学参数。OB通常用于确定口服给药的药物，其可能消除许多障碍以进入全身血液循环。DL用于准确预测“化合物”的含义，这可以很容易地帮助优化药代动力学和药物特性，如溶解度和化学稳定性[8]。以“丹参”和“葛根”为关键词，通过检索TCMSP数据库获取丹参-葛根的活性成分，筛选标准为OB≥30%且DL≥0.18[9]，将筛选所得的活性成分找到作用的蛋白名称，将蛋白名称复制到Uniprot数据库中以提取相应的靶点，整理并筛除重复项。

1.4 共有靶点筛选

将上述所获取的活性成分靶点和疾病靶点导入Venny2.1网站中得到化合物-疾病共有靶点个数，并绘制韦恩图。

1.5 共有靶点PPI网络构建

将共有靶点导入STRING数据库，设置物种为“Homo sapiens”，“minimum required interaction score(≥0.9)”并且隐藏网络中断开的节点，其他参数保持默认设置，获取相互作用关系，将相互作用关系数据导入Cytoscape 3.6.1软件绘制靶蛋白相互作用(PPI)网络，然后再使用该软件中的Network Analyzer对网络进行分析，并根据连接度(Degree，PPI网络中节点连接的边的个数；Degree值越大，说明该节点与其他节点联系更紧密，在网络中越重要)调整节点的大小并绘制PPI网络图。

1.6 GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析

将1.4收集得到的共有靶点的官方缩写上传到DAVID数据库，限定靶基因名称列表为“Homo sapiens”，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO富集分析包括分子功能(molecular function，MF)，细胞组分(cellular component，CC)和生物过程(biological proess，BP)三个部分。查阅相关资料分析对所得到的涉及靶点较多的通路进行分析，并绘图。

1.7 构建活性成分-靶点-通路网络图

将1.6得到的分数较高的通路和1.4收集到的共有靶点以及药物活性成分利用Cytoscape 3.6.0软件绘制成“活性成分-靶点-通路”网络图。

2 结果

2.1 冠心病靶点获取

通过检索DrugBank、TTD和Disgenet数据库获取的靶点并导入Uniprot数据库校正后分别筛选到84、6和913个靶点，删除重复项后共纳入981个靶点。

2.2 丹参合葛根化学成分及靶点获取

通过TCMSP数据库，根据设定的OB≥30%，DL≥0.18参数标准，共得到61个成分和纳入176个靶点。丹参和葛根的化合物信息如表2所示。

表2 丹参和葛根主要活性成分表

续表2(Continued Tab.2)

标识TCMSP ID结构式Structure化合物名称Compound口服生物利用度OB(%)类药性DL(%)MOL002651Dehydrotanshinone II A43.760.4MOL002776Baicalin40.120.75MOL000569Digallate61.850.26MOL000006Luteolin36.160.25MOL0070365,6-Dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-2,3-dihydro-phenanthren-4-one33.770.29MOL0070412-Isopropyl-8-methyl-phenanthrene-3,4-dione40.860.23MOL0070453α-HydroxytanshinoneⅡA44.930.44MOL007048(E)-3-[2-(3,4-di-hydroxyphenyl)-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid48.240.31MOL0070494-Methylenemiltirone34.350.23MOL0070502-(4-Hydroxy-3-methoxy-phenyl)-5-(3-hydroxypro-pyl)-7-methoxy-3-benzo-furancarboxaldehyde62.780.4

续表2(Continued Tab.2)

标识TCMSP ID结构式Structure化合物名称Compound口服生物利用度OB(%)类药性DL(%)MOL007058Formyltanshinone73.440.42MOL0070593-Beta-Hydroxymethylle-netanshiquinone32.160.41MOL007061Methylenetanshinquinone37.070.36MOL007063Przewalskina37.110.65MOL007064Przewalskinb110.320.44MOL007068Przewaquinone B62.240.41MOL007069Przewaquinone C55.740.4MOL007070(6S,7R)-6,7-dihydroxy-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-dione41.310.45MOL007071Przewaquinone F40.310.46MOL007077Sclareol43.670.21MOL007079Tanshinaldehyde52.470.45

续表2(Continued Tab.2)

续表2(Continued Tab.2)

续表2(Continued Tab.2)

标识TCMSP ID结构式Structure化合物名称Compound口服生物利用度OB(%)类药性DL(%)MOL007132(2R)-3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid109.380.35MOL007141Salvianolic acid G45.560.61MOL007142Salvianolic acid J43.380.72MOL007143Salvilenone Ⅰ32.430.23MOL007145Salviolone31.720.24MOL007150(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-quinone75.390.46MOL007151Tanshindiol B42.670.45MOL007152Przewaquinone E42.850.45MOL007154Tanshinone ⅡA49.890.4MOL007155(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-dione65.260.45

续表2(Continued Tab.2)

标识TCMSP ID结构式Structure化合物名称Compound口服生物利用度OB(%)类药性DL(%)MOL007156Tanshinone Ⅵ45.640.3葛根MOL000392Formononetin69.670.21MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL0029593′-Methoxydaidzein48.570.24MOL012297Puerarin[10]24.030.39

2.3 共有靶点筛选

将丹参和葛根的靶点和CHD的靶点通过Venny2.1构建韦恩图筛选共有靶点，结果见图1和表3。这些靶点既是药物作用的靶点，也是疾病的靶点。故丹参-葛根很可能是通过这些靶点发挥治疗作用。

图1 CHD和活性成分靶点韦恩图Fig.1 CHD and active ingredient target Venn diagram

表3 药物与疾病共有靶点表格

2.4 共有靶点PPI网络构建

将68个共有靶点导入STRING数据库中，以获取相互作用关系，再使用 Cytoscape 3.6.1绘制靶蛋白PPI网络图，见图 2。此网络共包括68个节点，160条边，平均Degree值为4.71，PPI富集P值<1.0e-16。图中Degree值越大则节点越大，结果提示丹参-葛根合用治疗CHD的靶标中Degree值排名前10的靶蛋白为AKT1、TNF、APP、ENDI、VEGFA、TP53、IL6、AGTR1、F2、RXRA。

图2 活性成分与疾病共有靶点PPI网络图Fig.2 PPI network map of active components and diseases

2.5 GO富集分析

在DAVID数据库中进行GO富集分析(P<0.05)，将分析数据下载下来，把Count 值前五名做柱状图分析，结果见图3所示。从生物过程的富集结果来讲，丹参-葛根治疗CHD的靶标主要参与RNA聚合酶II启动子的转录、DNA模板转录和炎症反应等过程的调节；从细胞组分的富集结果来说，丹参-葛根治疗CHD的靶标主要集中于细胞外空间、质膜和核等部位；从分子功能富集结果来说，丹参-葛根治疗CHD的作用主要体现在锌离子结合、细胞因子活性和序列特异性DNA结合等方面。

表4 GO富集分析结果

续表4(Continued Tab.4)

类型TypeGO富集GO Enrichment-log10值-log10 valueTranscription factor activity,sequence-specific DNA binding2.644 805 558Cytokine activity5.302 815 183Heme binding4.490 704 727CCExtracellular space9.419 996 155Plasma membrane2.823 022 69Nucleus1.599 008 676Integral component of plasma membrane1.682 525 526Cytosol1.591 033 308BPPositive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter7.893 632 792Transcription,DNA-templated3.680 761 64Inflammatory response4.086 251 625Positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade4.583 008 521Positive regulation of transcription,DNA-templated3.099 745 564

图3 GO富集分析结果柱状图Fig.3 GO enrichment analysis results histogram注：MF：分子功能；CC：细胞组成；BP：生物过程。Note:MF:Molecular function;CC:Cell composition;BP:Biological process.

2.6 KEGG通路富集分析

DAVID数据库中KEGG分析结果如表5所示，把Count 值前20个通路做柱状图分析，结果如图4所示。将KEGG分析结果导入Cytoscape软件中通过“CluGo插件”进行KEGG通路富集(P<0.05)，结果如图5。从图中可以看出包括炎症过程和免疫抑制(如TNF信号通路，T细胞受体信号通路)，心血管系统(如PI3K-Akt信号通路)和神经活性配体受体相互作用。丹参-葛根治疗CHD的主要作用过程包括HIF-1、PI3K-Akt、TNF和T细胞受体等信号通路。

2.7 构建活性成分-靶点-通路网络图

利用Cytoscape 3.6.0软件绘图结果如图6所示。由结果可知丹参-葛根配伍活性协同作用于成分多个靶点和多条通路，提示两药配伍可能有协同增效作用。如丹参中的丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、木犀草素(luteolin)与葛根中的葛根素(puerarin)涉及共有靶点的数目最多表示丹参-葛根配伍后主要是这三个活性成分来发挥药效的；这些活性成分又同时通过TNF、VEGFA、TP53和IL6等靶点，协同作用于HIF-1、PI3K-Akt、Jak-STAT和TNF等信号通路，表明丹参-葛根配伍使用较单味药的药效强。

表5 KEGG通路富集分析

3 讨论

本研究采用网络药理学方法研究丹参-葛根治疗CHD的作用机制。结果显示有68个与CHD相关的靶标，PPI网络分析表明，丹参-葛根配伍后可能存在协同作用参与 AKT1、TNF、VEGFA、TP53、IL6等靶点，提示该药对在治疗CHD中具有多组分、多靶点的特点。TNF是一种细胞因子，通常与炎症反应有关，其中TNF-α是一种非常重要的促炎因子，同时又能通过刺激相关血管生长因子的表达引起缺血后血管再生[11]；此外，VEGFA是促血管生成神经保护因子，可诱导神经发生[12]；IL6作为最重要的中枢基因，是一种T细胞和巨噬细胞衍生的细胞因子，参与多种生物活动，如严重的相位反应的产生、身体免疫系统的调节以及与运动期间的新陈代谢有关[13]；TP53是一种广泛表达于胚胎和肿瘤组织中的转录因子[14]。近年来的研究表明，TP53在平滑肌细胞分化中也发挥调控作用，提示对新靶点分子的识别，可能为心血管疾病的治疗带来新的药物启示[15]。KEGG代谢通路富集分析结果表明，丹参-葛根治疗CHD涉及HIF-1、PI3K-Akt、Jak-STAT和TNF等信号通路。TNF信号通路可促使促炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和TNF-α本身等基因的表达放大炎症反应和免疫效应[16]；HIF-1信号通路是缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路，HIF-1的活性对于组织缺血后的恢复是十分必要的。HIF-1可以上调与血管系统相关蛋白的基因表达，如促进血管生成的VEGF及其受体;使血管收缩的物质，如诱导型一氧化氮合酶等来增加血流，降低缺血损伤[17]；临床研究表明，PI3K-Akt 通路在CHD的发生和发展中起着特殊的作用，通过调节心肌细胞凋亡、血管内皮再生、 物质代谢和炎症反应，可影响CHD的发展[18]；Jak-STAT信号通路是细胞内重要的信号传导通路，而Cagnin等[19]通过DNA微阵列和meta分析人类冠脉粥样硬化斑块修饰基因的表达，发现Jak-STAT通路在心血管保护中起着重要的作用。有研究表明丹参酮ⅡA和葛根素协同作用于PI3K-Akt通路，对心脑血管疾病产生保护作用[20,21]。有研究表明，丹参-葛根合用较单独使用抗炎作用、舒张血管作用都明显增加，合用的疗效对心脑血管疾病都有很好的保护作用[22,23]。药物成分-靶点-通路网络分析结果显示丹参中的丹参酮ⅡA、木犀草素和葛根中的葛根素涉及共有靶点数目最多，提示这些化学成分可能参与了丹参-葛根配伍治疗CHD的过程。

图4 KEGG通路富集分析结果Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis results

图5 丹参-葛根治疗CHD信号通路富集分析图Fig.5 Analysis of enrichment of CHD signaling pathway in Danshen-Gegen

图6 药物成分-靶点-通路网络图Fig.6 Drug component-target-pathway network diagram注：橙色椭圆：活性成分；蓝色六边形：靶点；粉色长方形：通路。Note:Orange ellipse:active ingredient;blue hexagon:target;pink rectangle:pathway.

本研究结果表明，丹参-葛根中丹参酮ⅡA、木犀草素和葛根素等成分对TNF、VEGFA、TP53和IL6等相关靶点通过HIF-10、PI3K-Akt、TNF和Jak-STAT等信号通路参与炎症反应、血压调节、血管生成和收缩调节等过程。综上，丹参-葛根治疗冠心病的过程涉及多中有效成分、靶点和通路，符合中医药治疗疾病多成分多靶点多通路的特点；同时，本研究也可作为丹参-葛根治疗冠心病的分子机制，为深入研究丹参-葛根治疗CHD的作用机制提供思路和参考。