荧光显微镜的成像原理及其在生物医学中的应用

张宏宇

【摘  要】本文详述了几种常见显微镜的原理，其在生物医学中的应用，以供参考。

【关键词】荧光显微镜;原理;应用

引言

荧光成像技术在生命科学研究中具有越来越广泛的应用前景。普通荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜一般应用于组织、细胞的荧光成像;超分辨率显微镜则应用于亚细胞器等微小结构的成像，成像要求较高;而多光子激光扫描显微鏡更多应用于在体成像和离体厚组织样本的成像。根据不同的实验需求，科研人员正确选择合适的实验设备，将有助于提高科研效率。

1荧光显微镜的原理

传统的光学显微镜是基于样品的光吸收、相位梯度和双折射等进行成像，成像对比度低。荧光是当分子受到光激发时，电子从基态跃迁到激发态，经弛豫后再回到基态所辐射出的光。由于荧光物质的激发光谱与辐射光谱之间存在着斯托克斯位移，可采用滤光片滤出发射荧光。荧光显微技术通过利用样本发射荧光的特性对单个分子物质的时空分布进行成像，可显著地提高成像对比度。此外，可特异性荧光标记这一性能使得监测细胞内部含特定荧光团标记成分的位置及其扩散系数、转运特性、环境因素或与其他生物分子的相互作用等成为可能。常见的荧光标记物质主要有荧光染料、荧光蛋白和量子点等。其中，荧光蛋白作为活体荧光材料，具有良好的生物兼容性，被广泛应用于生物动态过程研究。

2激光扫描共聚焦显微镜技术组成和原理

激光扫描共聚焦显微镜系统包括激光光源，配备激发/抑制滤波器-分光器-光源/检测针孔荧-检测器的共聚焦扫描系统，配备微歩进马达的荧光显微镜、计算机控制系统和图像存储处理输出系统。用于激发荧光的激光束透过激发针孔被分光器反射，通过显微物镜汇聚后入射于待观察的标本内部焦点处。激光激发产生的荧光和少量反射激光一起被物镜重新收集后送往分光器。由于分光器的分光作用，残余的激光被分光器阻挡，不会被探测到。由于只有焦平面上的点所发出的光才能通过检测针孔，因此焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则呈黑色背景，反差增加，图像清晰。在成像过程中，检测针孔的位置始终与显微物镜的焦点是一一对应的（共轭），因而被称为共聚焦显微技术。光焦点在焦平面逐点逐行移动，将采集到的光信号直接传输到控制电脑，经光电信号转换后，控制软件可以把样品焦平面光信号进行虚拟成像，样品表面光信号强度以灰度表示，也可以渲染上色，对图像信息进行更好的展示和分析。由于在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，加之去卷积技术可确保获得更好的光学切片，分辨率提高了30%～40%，其光学切片性能使观察微观三维结构成为可能总体来说，激光扫描共聚焦显微镜具有图像采集、荧光信号定性和定位、荧光强度定量测定等基本功能。其中，图像采集是荧光信号定位、定性和定量的基础和前提。与其他光学成像技术相比，CLSM具有很多优势：无损伤扫描保持样品的完整性、采集多重波段荧光、实现多种荧光信号的共定位分析、图像质量较高、操作控制灵活;定性和定位荧光物质、定量测定荧光信号等。该技术被广泛用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面，是生命科学、地球科学、环境科学等领域新一代强有力的研究工具。

3超分辨率显微镜

3.1超分辨率显微镜工作原理

目前，超高分辨率成像的方法包括：结构照明显微技术（SIM）、光敏定位显微技术（PALM）、随机光学重构显微技术（STORM）和受激发射损耗显微技术（STED）。SIM成像是在宽场荧光显微镜的基础上，对样品进行结构照明，利用照明后产生的莫尔条纹来提高分辨率。SIM通常是获得一组图片后进行重构，其分辨率可突破光学极限，提高到原来的两倍（横向分辨率约为100nm）。PALM和STORM技术则首先激发部分样品的荧光信号，对其进行分子定位，然后不断循环该过程，得到不同的定位点最后进行叠加为重构的超高分辨率的图像，STORM的分辨率可提高10倍（横向分辨率约为20nm），有利于观察到以往所不能观察到的结构。STED则利用一束激发光使荧光物质发光的同时，用另外的高能脉冲激光器发射一束紧贴着的、波长较长的激光将第一束光斑大部分荧光物质通过受激发射损耗过程淬灭，剩下的可激发荧光区被限制在小于衍射极限的区域内，于是获得一个小于衍射极限的光点。

3.2超分辨率显微镜特性

SIM技术的优点是样品处理与普通荧光标记样品处理相同，不足之处是成像分辨率有限，较共聚焦显微镜提高2倍。PALM和STORM成像技术的优点是分辨率有很大的提高，不足之处是成像过程中需要用到特殊的imagebuffer，样品前处理较为复杂，对系统稳定性要求高。STED技术最大的优点是可以快速地观察活细胞内部实时变化的过程，在生命科学中应用更为广泛，其主要缺陷是设备昂贵，对系统稳定性要求高。

3.3超分辨率显微镜应用范围

超分辨率显微镜的出现拓展了新的研究内容，已逐渐应用于观察蛋白质之间的组合关系来了解他们之间的相互作用，为后续的细胞功能实验研究打下基础;也有利于研究分子之间的差异;还能用于在单分子水平上研究蛋白动态组装的过程，揭示新的发现，有助发现更多的生命奥秘。

4荧光显微镜的应用

采用搭建的荧光显微镜观察脑组织切片，检验系统的性能。生物样品为Thy1-YFP（H）成年转基因小鼠的脑切片，其中YFP主要表达在脑皮层的第5层及海马区的锥形神经元。YFP的峰值发射波长为529nm，与上述所选择的滤光片套装相匹配。

4.1大视场、低分辨率成像

首先使用低倍率物镜进行大视场观察.采用4×、数值孔径0.13的物镜和10×目镜组合所拍摄的小鼠脑组织冠状切片荧光图像，可见，其视场范围可以涵盖小鼠的整个半脑，但是成像空间分辨率低，仅仅能分辨神经元胞体，对于更精细的神经元结构（例如树突、轴突）则难以分辨。实验中可进一步验证，仅通过对图像进行数字放大，无法提高成像的空间分辨率。

4.2小视场、高分辨率成像

将物镜切换至高倍率、高数值孔径物镜，可实现小视场、高分辨率成像。数值孔径0.5的物镜和10×目镜组合所拍摄的小鼠脑组织冠状切片的荧光图像数值孔径0.5的物镜和10×目镜组合所拍摄的荧光图像.相比较来说其视场范围减小，但是，神经元的树突以及由轴突构成的纤维束都清晰可见。

综合上述实验可见，实际成像中需要在光学显微系统中成像视场与空间分辨率之间进行折中选择。为了获得高分辨率的图像，成像视场往往受到限制;反之亦然。

结束语

文中所述各类型荧光显微镜有各自的特点，互相补充，可在成像清晰度、成像结构精细度和成像深度等方面满足科研工作的不同需求。科研人员准确理解各类型荧光显微镜的相关知识与应用领域，有助于其正确选择合适的仪器设备，提高科研水平，有助于提高贵重仪器的使用效益，减少资源浪费。

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（作者身份证号码：130204198208231812）