铁基纳米酶的研究进展

王杨

（苏州健雄职业技术学院，江苏 太仓215411）

研究发现，天然酶是一种能够催化特定化学反应的蛋白质、RNA 或其复合体，具有催化活性高、选择性强和反应条件温和等优点，被广泛用于疾病诊断、临床治疗、生物传感和环境保护等领域[1-2]。但天然酶具有环境稳定性差、易被酶消化、制备成本高、纯化复杂等缺点，限制了其应用的范围。近年来，随着纳米技术的发展，一些纳米材料，例如金属氧化物纳米粒子、金属纳米粒子、富勒烯衍生物和稀土纳米材料等，被证实能够模拟过氧化物酶和超氧化物酶等多种天然酶的活性[3-5]。随之，纳米酶作为天然酶的替代物，迅速成为多学科交叉的研究热点，并逐渐形成了新的研究领域。自从阎锡蕴课题组[6]发现Fe3O4纳米粒子具有类似天然酶的过氧化物酶(peroxidase,POD)活性以来，铁基纳米酶因其良好的催化活性、低成本和稳定性好等优点引起了研究者们的广泛关注，并在生物医药领域得到广泛应用。

本文主要介绍了铁基纳米酶的催化机制与活性、分类以及应用等方面的研究进展，并对其研究进展进行了展望。

1 铁基纳米酶的催化机制与活性

1.1 催化机制

在自然界中，过氧化物酶是由大量酶组成的一类氧化还原酶（POD），能够催化底物与过氧化物（多数为H2O2）的氧化反应(图1)。这种催化作用使得POD 在生物体内起着非常关键的作用，例如降低活性氧自由基的毒性和抵御病原体。以辣根过氧化物酶(HRP)为例，其活性中心存在一个含铁的卟啉环，通过铁原子的氧化还原实现酶的高效催化，因此通常用作抗体的偶联物，已广泛用于生物分析和临床检验，以酶促催化比色底物进行信号传导或成像。Fe3O4纳米酶最早被发现具有POD活性，催化反应机制符合芬顿反应机制。铁基纳米酶表面的大量铁原子中Fe2+/Fe3+之间的转换是保证其酶活性的关键。图1(a)所示为酸性条件下铁基纳米酶的POD酶模拟催化机制。Fe3+与H2O2反应生成羟基自由基，这表明过氧化物酶模拟活性符合芬顿机制。在中性(pH=7.4)和碱性条件下，ESR技术未检测到羟基自由基，但反应中有气体产生，表明不同于POD 的酶催化活性机制（图1(b)）。在中性或碱性环境下，Fe3+与H2O2结合快速生成过量的FeOOH2+和氢过氧自由基(HO2·)，之后HO2·迅速被离子化为超氧阴离子(O2-)，产生的HO2·/O2-再通过与羟基自由基反应进一步转化为H2O与O2，即表现出显著的过氧化氢(CAT)催化活性[7]。

图1 铁基纳米酶催化反应机理[7]

为了证实氧化铁纳米酶的活性是来自纳米材料，而非来自浸出的活性组分（如基于氧化铁纳米酶的铁离子）。原子吸收光谱法测试结果表明，Fe3O4磁性纳米粒子可能会浸出很少量铁离子，离子数量太少无法表现出明显的催化活性，进一步证实了铁基纳米酶的活性来自氧化铁纳米粒子，而不是浸出的离子[8-9]。Tang 等使用了EPR 分析和自由基抑制实验阐明基于氧化铁催化有机污染物降解的反应机制[10-11]，研究结果表明O2·-/HO2·-占主导地位。

1.2 活性调节

铁基纳米酶与天然酶相似,其活性受到环境因素的影响，例如pH 和温度，此外，铁基纳米酶催化活性还可以通过纳米材料的尺寸、形态、结构和表面改性调节。纳米酶的活性与材料的尺寸大小有关，通常尺寸越小，活性越高，这是由于较小的纳米粒子具有较高的表面积与体积比，因而比较大的纳米粒子的酶活性高[12]。

纳米酶的结构和形态在调节其催化活性方面也起着关键作用。刘等[13]详细地研究了Fe3O4MNPs 的结构和形态对其过氧化物酶模拟活性的影响，与三角盘和八面体相比，球状的粒子由于具有较高的比表面积被观察到具有最高的活性。对于具有相似大小和表面积的三角形板和八面体，活性的差异是由于它们的表面原子排列所致。

在磁性纳米材料表面进行改性，不仅可以改善其具有的自发聚集的缺陷，还可以增加纳米材料的表面电荷和稳定性，例如表面涂层、基团修饰、蛋白质保护和使用载体分散等[14]。表面涂层是常用的改性方法之一。通常，表面涂层对具有纳米酶核的催化活性具有屏蔽作用，可能降低其与对底物的催化效果，可控制涂层的工艺，调整涂层厚度、大小以及修饰基团的堆积密度，以进一步调整纳米酶的活性[15]。例如，当Fe3O4MNPs表面涂有SiO2、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、聚乙二醇或葡聚糖时，葡萄糖改性的Fe3O4MNPs表现出最高的酶活性。进一步研究发现，对于给定的聚合物涂层（例如聚乙二醇或葡聚糖），涂层的分子量和厚度与活性呈反比关系。有些涂层不仅不会屏蔽纳米酶的活性，还会增加其酶活性。例如，在氧化铁磁性纳米粒子表面包覆普鲁士蓝，普鲁士蓝含量越高，纳米酶的活性反而越高[16-17]。基团修饰包括无机阴离子（如PO43-）和生物分子（如多巴胺、维生素C和蛋白抗体）等。例如，磷酸根(PO43-)在生命体系具有重要作用，与Fe3O4纳米粒子配位，不仅可调节纳米酶的活性，还能进一步扩大纳米酶的应用范围[18]；多巴胺与Fe3O4发生配位作用，可以增强Fe3O4纳米粒子的过氧化物酶活性[19]。

2 铁基纳米酶的分类

2.1 金属合金纳米粒子

2013年，刘鸿课题组[20]通过一步还原法合成了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)保护的、具有过氧化物模拟酶性质的Fe-Co 双金属合金纳米粒子（Fe-Co NPs）。研究表明，与单纯的Co 纳米粒子或Fe 纳米粒子相比，Fe-Co NPs具有更好的POD 活性，并且活性强度与铁和钴的比例有关，当铁和钴的摩尔比为1∶1 时，酶的活性最高。在测定葡萄糖浓度的比色分析中，Fe-Co NPs 与葡萄糖氧化酶发生作用能够产生H2O2，葡萄糖最低检出浓度为0.01 μM，线性范围为0.5～10 μM。刘青云[21]课题组采用溶剂热法制备了Fe Pt-Au 三元金属杂化纳米粒子（FePt-Au HNPs）。研究结果表明，FePt-Au HNPs 具有很高的H2O2亲和力，H2O2存在下30 s内即可通过肉眼观察到蓝色。比色分析结果表明检出限为12.33 μM。同一年，课题组通过将Fe 和Pt 的纳米粒子同时修饰到石墨烯氧化物纳米片上，使活性位点很好地分散于氧化石墨烯中，得到的纳米材料具有明显的CAT催化活性，不仅显色快，而且检出限更低(0.22 μM)[22]。

2.2 Fe3O4纳米材料及其衍生物

自从阎锡蕴课题组发现Fe3O4纳米粒子具有POD活性，基于Fe3O4的纳米酶由于合成的尺寸可控、高活性，逐渐成为研究热点。目前，Fe3O4纳米粒子的制备方法有共沉淀法、热分解法、溶胶热法、溶胶凝胶法和声化学法等[23-26]。2008年，汪尔康课题组采用共沉淀法合成了Fe3O4纳米粒子，并作为POD 模拟物开发了用于H2O2和葡萄糖检测的新型传感平台。报道中，使用底物ABTS可通过简便的比色反应检测H2O2的浓度[27]，结果表明，H2O2的检出限为3×10-6mol/L，线性范围为3×10-6～1×10-4mol/L。2012 年，阎锡蕴课题组[28]基于Fe3O4磁性纳米粒子（Fe3O4MNPs）开发了一种快速检测有机磷农药和神经毒剂的比色传感平台。该方法所需的装置不仅简单、廉价，而且对于多种有机磷具有较高的灵敏度，例如甲基对氧磷、乙酰甲胺磷和沙林。不久，Cheng 等选择性地制备了具有优异的POD活性的单晶菱形十二面体的Fe3O4纳米晶体（RD Fe3O4NCs）。该材料的尺寸在60～100 nm范围内可调，并能够在H2O2存在下催化降解有机染料，同时还具有锂储存性能[29]。随着纳米技术的不断发展，Fe3O4纳米材料出现了越来越多样化的形貌，除了球形和十二面体的形貌外，还有八面体、簇球、纳米纤维状等形貌的Fe3O4纳米材料[30]。Liu 等证实了不同形貌的Fe3O4纳米晶体，例如簇球、八面体和三角形晶格等，其表面不同的晶面和原子排列导致了其不同的催化性能。Fe3O4纳米晶体表面的能量越高，催化活性越好。与三角形和六面体Fe3O4纳米晶体相比，纳米Fe3O4簇球酶活性最高[15]。

Fe3O4磁性纳米材料改性后的衍生物不仅具有更优异的酶活性，还可以改善其固有的缺陷。2018 年，Sivanesan等使用ZIF-67和Fe3O4MNPs合成了ZIF-67包覆的Fe3O4@ZIF-67 纳米酶，并在此基础上开发了一种便捷的比色传感用以检测Hg2+。研究结果表明，Fe3O4纳米粒子均匀分布在ZIF-67表面，谷胱甘肽(GSH)的存在阻碍或延缓了3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，Hg2+的加入会与GSH 的巯基发生相互作用，从而促进TMB的氧化而发生显色反应[31]。任何军等[32]报道了一种维生素C(Vc)修饰的Fe3O4磁性纳米粒子(Vc Fe3O4MNPs)作为催化剂的简单有效的比色生物传感，用于检测过氧化氢和葡萄糖。动力学研究表明，修饰基团维生素C改善了纳米材料对H2O2的亲和力。H2O2检出限为0.29 μmol/L，检测线性范围为0.5～100 μmol/L；葡萄糖检出限为0.288 μmol/L，线性范围为0.5～25 μmol/L。

研究发现，天然酶通过酶簇共同在生物体内发生催化作用，因此，可将Fe3O4纳米粒子与其他相似酶催化活性的纳米材料复合在一起，通过材料之间的协同作用提高酶催化活性。Lee 等[33]合成了哑铃状Au-Fe3O4纳米磁性粒子复合材料，研究结果表明，与单纯的Fe3O4纳米酶相比，Au 对Fe3O4的极化作用使得复合物具有更高的CAT活性。Wu等[34]将Fe3O4与石墨烯量子点（GQDs）合成了复合纳米材料GQDs/Fe3O4。GQDs 的独特性能以及GQDs与Fe3O4之间的协同作用，使得所制备的复合纳米材料比单纯的Fe3O4、GQDs 和HRP 具有更高的POD活性。Zhang等[35]采用CuS和卟啉共同修饰壳聚糖包裹Fe3O4纳米粒子合成新型多功能纳米酶（FCCP NPs），以实现光热协同治疗，为肿瘤诊疗提供了新方法。该纳米材料通过其中的卟啉光敏剂在近红外光照射下产生的羟基自由基和O2实现光动力疗法，其中的CuS具有显著的光热疗效果，能够有效地诱导杀死肿瘤细胞。

2.3 氧化铁及其衍生物

基于Fe2O3的纳米材料同样也具有过氧化氢酶和过氧化物酶的特性，可用于靶向和肿瘤组织的可视化，且其酶催化效率受到形貌的影响。铁蛋白的天然无机核是水合氧化铁亚铁酸盐，其过氧化物酶的模拟活性非常低。尽管天然存在的水合氧化铁亚铁酸盐的活性很小，但在某些含氧化铁的细胞器中发现了过氧化物酶模拟活性，例如磁小体和铁质体[36-37]。为了提高酶的活性，可通过铁蛋白内部铁离子的原位氧化来对磁芯进行构建，从而生成具有过氧化物酶优异催化性能的磁铁蛋白纳米粒子。对于尺寸大小相近的Fe3O4与Fe2O3纳米粒子的酶催化性能，Fe3O4纳米粒子显示出更高的过氧化物模拟酶活性[38]。Chaudhari等[39]研究了六角棱柱、立方体和棒状的不同形貌对α-Fe2O3纳米酶性能的影响。动力学研究表明，Km值按照六角棱柱、立方体和棒状的次序逐渐降低，表明呈现一维结构的α-Fe2O3酶催化活性最高，上述结果为Fe2O3纳米酶的开发提供了理论指导。2015 年，Tang 等[40]通过γ-Fe2O3和SiO2合成了一种新型的具有过氧化物酶活性的多功能复合球形Janus 纳米酶，用于H2O2和葡萄糖检测中的生物传感。研究发现，Janus纳米微球具有优异的过氧化物酶活性以及分离和浓缩的磁性功能，其中SiO2的引入有利于微球表面改性和生物偶合。作者进一步将葡萄糖氧化酶（GOx）固定于Janus 纳米微球上，用于葡萄糖比色传感。研究结果表明，固定GOx的Janus纳米颗粒不但可以快速、灵敏地检测葡萄糖，而且通过磁性响应可轻松将样品进行分离/浓缩，回收和再利用，并对于复杂样品（如血清）中的葡萄糖可进行重复检测。Wood等[41]系统地研究了介孔氧化铁（IO）的晶体相态（γ-Fe2O3和α-Fe2O3）对其过氧化物酶活性的影响，并证明了不同晶相的介孔氧化铁作为纳米酶的适用性。研究结果表明，γ-Fe2O3和α-Fe2O3均具有过氧化物酶活性，可用于检测葡萄糖生物标识物。与α-Fe2O3相比，介孔γ-Fe2O3对发色物质（例如TMB 和ABTS）的催化氧化显示出较高的纳酶活性和磁性。此项工作对具有晶体结构的氧化铁纳米酶的开发和生物应用具有一定的指导意义。

2.4 其他

2.4.1 其他铁基氧化物

掺杂铁氧体，例如MFeO3（M=Bi，Eu）和MFe2O4（M=Co，Mn，Zn）也被发现具有过氧化物酶的活性。MFe2O4是一类具有立方尖晶石结构的铁氧体，其中一半的Fe3+和M2+占据八面体间隙位点，而另一半占据四面体位置[42]。例如，CoFe2O4磁性纳米(MNPs)粒子作为过氧化物模拟酶可通过化学发光检测H2O2和葡萄糖。2011 年，黄玉明课题组[43]构建了一种基于CoFe2O4MNPs，通过研究证实了CoFe2O4MNPs 的POD 活性。动力学研究表明，纳米材料的催化反应过程遵循米氏动力学，并且对底物OPD 与TMB 具有良好的亲和力；ESR 结果表明，CoFe2O4MNPs的结构能够将H2O2催化分解产生·OH，并在此基础上开发了用于检测H2O2和葡萄糖的化学发光传感器。除了CoFe2O4，MnFe2O4也具有模拟酶的活性。Vernekar等[44]探究了材料的形态对MnFe2O4氧化酶活性的影响。结果表明，优化反应条件可以调整材料的形态从一维到三维变化，结构为八面体的纳米材料由于有利电子相互作用，具有较好的底物亲和力，因此具有最高的氧化酶活性。除了上述常见的铁基双金属氧化物外，一些其他的铁基氧化物也具有优异的模拟酶活性。孙承君课题组[45]在不同pH 条件下合成了FeVO4纳米晶体，并探讨了纳米晶体的不同形貌对其过氧化物酶活性的影响。实验结果表明，当pH 为4 时，带状的FeVO4纳米晶体具有最大的比表面积和最好的过氧化物酶活性。基于此课题组开发了一种高灵敏度的过氧化氢光学检测系统，检出限为0.2 μM。除了上述纳米材料，其他的铁基氧化物也具有很好的模拟酶活性，例如FeMnO3[46]、Fe2(MoO4)3[47]、FeOOH[48]以 及 Fe3(PO4)2·8H2O[49]等。

2.4.2 其他铁基纳米材料

除氧外的其他杂原子与铁的化合物也被证明具有模拟酶活性。Ju 等用胶束辅助的方法制备了FeS 纳米片，并研究了它们的过氧化物酶模拟活性[50]。由于具有较大的比表面积，这些FeS 纳米片和FeS 纳米针均表现出比球形FeS纳米材料更好的酶催化活性，可用于开发检测H2O2的安培计传感器[51-52]。随着人们对纳米酶的研究越来越深入，还有其他一些铁基纳米材料也被报道具有过氧化物酶活性，例如FeTe 纳米棒[53]、石铁取代的SBA-15微粒[54]、[FeIII（双缩二脲-酰胺）][55]、Fe（III）基配位聚合物纳米微球[56]和磷酸铁微花[57]、金属-有机骨架（MOF）(例如MIL-53（Fe）)[58]、MOF 结合其他材料所得的复合物（如Fe3O4@MIL-100（Fe）NPs[59]和AgNPs/MIL-101（Fe）[60]），以及层状双金属氢氧化物（LDH）（如Fe Co-LDH[61]）等。

3 铁基纳米酶的应用

3.1 分析检测

（1）H2O2检测

H2O2的检测在生物学、医学、环境保护和食品工业等许多领域都具有重要意义。基于纳米酶的H2O2的检测方法有比色法、荧光法、化学发光法和电化学法。比色法是利用纳米酶催化H2O2与比色底物发生氧化作用后产生的颜色变化。荧光法和化学发光法是利用底物被氧化后产生的荧光信号的变化。荧光试剂罗丹明B和CdTe 量子点被H2O2氧化时会导致荧光猝灭；而某些非荧光底物BA经H2O2氧化后生成荧光性的产物，例如鲁米诺作为底物时，经H2O2氧化后会导致化学发光，这些均可用于开发检测H2O2的信号传感器。电化学为天然HRP 和纳米酶提供了一种便捷的H2O2检测方法。Dong 和同事们在掺杂锡的氧化铟（ITO）电极上，使用Fe3O4MNPs 和聚（二烯丙基二甲基）二甲基亚甲基铵（DNP）进行静电作用逐层组装，开发了第一个电化学传感器[62]。该传感器具有良好的灵敏度，H2O2检出限为1.4 mM，并且对H2O2的选择性高于抗坏血酸和尿酸。基于纳米酶开发的检测H2O2的电化学传感器具有良好的选择性，已用于牙膏、杀菌剂/口服清创剂、漱口液等商品中H2O2的测定。

（2）葡萄糖检测

葡萄糖检测在临床和食品分析中非常重要，对改善人们的生活质量非常有意义。通常，葡萄糖氧化酶（GOx）由于具有特异性和高效率，被广泛用于葡萄糖检测。在GOx 存在下，用分子氧催化葡萄糖氧化生成H2O2，可以通过许多分析方法（例如HRP 催化的比色法和电化学方法）进一步确定葡萄糖的浓度。使用纳米酶代替GOx有许多优点，如稳定性、耐候性和可回收性，并且能够选择性地检测血清样品和尿液样品中的葡萄糖浓度。与H2O2检测类似，通过改变使用的纳米酶和底物，已经开发出多种葡萄糖检测分析方法，其应用范围也越来越广泛。

（3）DNA和蛋白的检测

铁基纳米酶应用于DNA 检测的原理是：当双链DNA 通过静电作用吸附于Fe3O4MNPs 纳米酶表面时，对样品进行聚合酶链式反应(PCR)，产生的大量核酸使显色底物显色[63]。该方法可用于选择性地检测人尿液中的乳头瘤病毒DNA、沙眼衣原体以及埃博拉病毒等[64]。目前，蛋白质的检测方法主要是以免疫测定法为主，以利用抗体和抗原之间的独特识别来实现蛋白质的高效检测。抗体修饰氧化铁磁性纳米粒子被发现具有捕获、分离和检测蛋白的功能。Park等将葡聚糖修饰的氧化铁纳米颗粒（70 nm）与单克隆抗CRP抗体偶联后，作为超顺磁性标记，利用免疫测定法快速检测了全血中的C反应蛋白（CRP）[65]。

3.2 肿瘤治疗

铁基纳米酶可利用其POD 活性将肿瘤内部过表达的H2O2催化分解为羟基自由基而诱导癌细胞死亡。纳米酶也可以作为抗氧化剂，消耗体内活性氧（ROS），降低其浓度，用于维持机体的稳态。Gu 课题组选用胶质瘤U251 细胞作为研究对象，将其与铁磁纳米粒子共孵育12 h 后，证实了纳米材料在肿瘤细胞弱酸性微环境中呈现POD 活性，通过促进自由基的生成有效地杀死肿瘤细胞[66]。Zhang等[67]发现普鲁士蓝修饰的氧化铁纳米粒子（PBNPs）具有包括POD、CAT和超氧化物歧化酶（SOD）在内的多酶样活性，能够有效清除ROS；小鼠的体内炎症模型证实PBNPs 能够抑制或缓解ROS 引起的损伤。超顺磁性氧化铁纳米粒子被发现能够有效标记hMSCs，并能够显著诱导hMSCs 增殖，这是由于其POD模拟活性能够消除细胞内H2O2，同时纳米材料内化后被降解为游离铁离子，加速了细胞周期进程，促进了缺血组织中血管的生成。Shi等提出了另一种利用铁基纳米酶杀死肿瘤细胞的方法[68]，他们制备了一种新型的装载超小Fe3O4纳米粒子和葡萄糖氧化酶（GOx）的介孔SiO2复合纳米材料（GOx-Fe3O4@DMSNs），证实了GOx-Fe3O4@DMSNs 纳米粒子进入肿瘤细胞后，释放的GOx与肿瘤中葡萄糖产生大量的H2O2，而释放的Fe3O4与H2O2作用，产生能够杀死肿瘤细胞的羟基自由基（·OH）。

3.3 成像

Fe 基纳米酶由于含有铁元素和酶的催化性质，可以产生具有颜色和有荧光的产物，这些特性可以用于成像。Yan和Liang的研究小组通过将氧化铁纳米粒包封于重组人重链铁蛋白（HFn）蛋白壳的空穴中制备得到磁铁蛋白纳米粒（M-HFn），作为肿瘤靶向和肿瘤组织可视化。其中的HFn 通过表达的转铁蛋白受体1（TfR1）蛋白直接与肿瘤细胞靶向结合，而作为内核的氧化铁纳米粒子，能够催化过氧化物酶底物氧化产生有色产物，实现肿瘤组织可视化。为了验证M-HFn 纳米材料的准确性、特异性和灵敏性，研究小组对患有9 种癌症的474 份患者临床标本（247 份临床肿瘤组织标本与227 份正常和病变组织对照标本）进行了检测，结果表明，该纳米酶能够以98%的敏感性和95%的特异性区分癌细胞与正常细胞[69]。

3.4 环境监测与废水处理

开发高效、耐用且低成本的催化剂对于环境监测与废水处理非常有意义。铁基纳米酶具有过氧化物酶活性，产生的ROS 可用于检测和降解废水中的污染物。更有意义的是铁基纳米酶可利用自身固有的磁性实现重复利用，大大节约了废水处理的成本。废水中的污染物主要包括染料类、有机磷农药、木质素和其他的有机化合物，例如，Fe3O4MNPs作为催化剂，苯酚的去除率高达85%[70]，通过比色法可快速检测有机磷农药、乙酰胆碱酯酶（AChE）和胆碱氧化酶（CHO）[71]。

4 结论与展望

作为天然酶的替代物，铁基纳米酶不仅具有优异的酶催化活性，而且具有性能可控、制备简单、成本低和耐候性好等优点。铁基纳米酶中Fe2+/Fe3+之间的转换是保证酶催化活性的关键。在酸性条件下，铁基纳米材料具有POD 活性，通过芬顿反应与H2O2反应生成羟基自由基；在中性和碱性环境中，铁基纳米材料与H2O2反应生成H2O 与O2，表现出过氧化氢(CAT)催化活性。铁基纳米酶主要应用于分析检测、癌症治疗、成像、环境检测与废水处理等领域。然而，在铁基纳米酶的研究中还存在以下挑战：催化活性主要集中在氧化还原反应上，催化反应的特异性不如天然酶，容易引起机体代谢紊乱而产生一定的毒性等。因此，开发新型低毒、高稳定性和特异性的铁基纳米酶仍然是未来研究的方向。