达氏鲟2种胰岛素样生长因子的克隆及其对饥饿胁迫的响应

陈叶雨，刘 亚，赖见生，宋明江，龚 全

(四川省农业科学院水产研究所，四川 成都 611731)

【研究意义】胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)是一类与胰岛素前体具有同源性的细胞增殖调控因子，由多种同源多肽组成，在细胞生长、分化、调节渗透压、繁殖、免疫应答和新陈代谢等过程中起着重要的作用[1-3]。自IGFs被发现具有生长调节的功能以来，IGF系统及其衍生功能也被相继发现和阐明，特别是IGFs参与肿瘤发生、发展及转移的分子网络越来越受到重视。【前人研究进展】1989年，Cao等[4]首次从鲑(Oncorhynchustshauytscha)中克隆得到IGF-1cDNA，随后金鱼(Carassiusauratus)[5]、银大麻哈鱼(Oncorhynchuskisutch)[3]、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)[6]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]、青鳉(Oryziaslatipes)[8]、虹鳟(O.mykiss)[9]、鲫(Carassiusaurat)[10]、哲罗鲑(Huchotaimen)[11]等IGF相关基因相继被克隆。随着研究深入，IGFs家族基因相继被发现，如斑马鱼(Daniorerio)性腺中存在IGF-1a、IGF-1b、IGF-2a和IGF-2b4种亚型[12-13]，最近，家族基因IGF-3也在斑马鱼中被发现，且具有刺激生殖细胞分化、调节精巢和卵母细胞的发育等功能[14]。IGF-1和IGF-2主要通过IGF-1受体来刺激细胞反应，然而，其功能存在一定的差异[15]。IGF-1主要来源于肝脏，在生殖前期受生长激素GH调控，在鱼类肌肉生长和代谢中起到重要作用[16]。IGF-2参与卵黄的生成，主要作用于胚胎生长和发育阶段，不受生长激素调节[17]。【本研究切入点】达氏鲟，又名长江鲟，隶属鲟形目，鲟科，鲟属，为我国一级保护动物。受人为活动的影响，野生资源急剧下降，现阶段主要采取人工保育的方式进行种群的扩增[18]。虽然达氏鲟人工繁殖技术已获得突破，但其繁殖生理及生长特性的分子机理有待进一步挖掘。本研究通过克隆IGF-1和IGF-2基因，得到了其cDNA全长序列，并研究其在不同组织及饥饿胁迫作用下的表达模式。【拟解决的关键问题】本研究结果以期为进一步了解IGF-1和IGF-2在达氏鲟生殖生理和生长过程中的功能奠定基础，也为下一步良种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

达氏鲟为四川省农业科学院水产研究所2018年繁殖的F2代，体重为(30±2)g。将实验鱼用MS-222进行麻醉，然后解剖。同时将心脏、肝脏、脾脏、肾脏、性腺、肌肉、肠、鳃、皮肤、眼、脑取出，液氮中速冻，然后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 RNA提取及cDNA合成

取上述组织30 mg左右于液氮中研磨，使用Trizol法提取总RNA，提取后取3 μl总RNA样品通过1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测其质量和完整性，用超微量分光光度仪测定RNA样品的浓度和纯度。质量检测合格的RNA样品参照ReverTra Ace反转录试剂盒(TOYOBO, Japan)说明书合成第一链cDNA。

1.3 IFG-1和IFG-2基因克隆

利用本实验室前期达氏鲟转录组测序获得的unigene序列为基础(accession numbers SRR6167299, SRR6172670, SRR6173479, SRR6175 505, SRR6179331和SRR6179394)，通过NCBI数据库进行比对分析，获得了达氏鲟IGF-1和IGF-2的cDNA全序列。为验证序列的正确性，分别在ORF上下游设计验证引物(表1)，以反转录cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物连接载体后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4 序列分析

运用Vecter NTI软件预测达氏鲟IGF基因的ORF，并推测其编码氨基酸序列，计算编码产物分子量和等电点；信号肽序列使用在线工具SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行预测。利用Cluxtal X将达氏鲟的IGF-1和IGF-2序列分别与其他物种的相应基因序列进行多重比对，利用Mega 6.0软件的Neighbor-joining法构建系统进化树。

1.5 组织表达分析

选取5尾健康达氏鲟，采用实时荧光定量PCR技术检测IGF-1和IGF-2基因在达氏鲟11个组织中的相对表达量。PCR反应体系为25 μl，包括5 μl稀释后cDNA(原始浓度稀释20倍)，12.5 μl 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，上下游引物各1 μl(10 μM，表1)，灭菌双蒸水5.5 μl。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，42个循环；最后70～95 ℃获取溶解曲线并确保扩增产物的特异性。选取β-actin作为内参基因，引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法计算样品中IGF基因mRNA的相对表达量。

1.6 饥饿胁迫下达氏鲟IGF表达量的检测

选择75尾健康、活力好的达氏鲟进行饥饿实验，为期14 d，实验期间充氧，水温25～27 ℃。实验鱼分5组，每组3个平行，分别为对照组(饥饿0 d)、实验1组(饥饿1 d)、实验2组(饥饿3 d)、实验3组(饥饿7 d)和实验4组(饥饿14 d)。分别在饥饿实验的0、1、3、7和14 d采集肌肉、肠道及肝脏3个组织的样本，每个平行采集3尾。每尾样本取组织约30 mg进行液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存。

表1 IGF基因克隆和荧光定量PCR检测所用引物

1.7 数据分析

采用平均值±标准误(Means±S.E.)表示实验数据，采用SPSS22.0软件处理结果。基于单因素方差分析基础上，采用Ducan多重比较法对组间差异进行检验，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 达氏鲟IGF-1和IGF-2克隆及序列分析

达氏鲟IGF-1基因的cDNA全长为2622 bp(GenBank序号为MK955784)，见图1。其中，5′非编译区为292 bp，开放阅读框为489 bp，3′非编译区为1841 bp，3’UTR区域有明显的多聚腺苷酸化信号AATAAA序列。序列分析表明，达氏鲟IGF-1cDNA的ORF编码包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E区6个区域共162个氨基酸。去掉信号肽和E区域后，达氏鲟IGF-1包含71个氨基酸残基的成熟肽，可划分为B区(29个氨基酸)、C区(12个氨基酸)、A区(21个氨基酸)、D区(9个氨基酸)，分子量为8.0 kDa，等电点(pI)为8.64。

达氏鲟IGF-2基因的cDNA全长为1821 bp(GenBank序号为MK955785)，见图2。其中，5′非编译区为109 bp，开放阅读框为660 bp，3′非编译区为1052 bp，3’UTR区域有明显的多聚腺苷酸化信号AATAAA序。序列分析表明，达氏鲟IGF-2cDNA的ORF编码包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E区6个区域共219个氨基酸。去掉信号肽和E区域后，达氏鲟IGF-2包含70个氨基酸残基的成熟肽，可划分为B区(32个氨基酸)、C区(10个氨基酸)、A区(21个氨基酸)、D区(7个氨基酸)，分子量为7.8 kDa，等电点(pI)为8.30。

2.2 系统进化分析

将达氏鲟的IGF-1和IGF-2分别和其他物种相应的IGF序列进行比对，采用Mega 6绘制系统进化树，如图3。结果显示，达氏鲟的IGF-1和IGF-2均可与其他物种的IGF亚型聚类，其中，IGF-1与波斯鲟聚为一支，IGF-2与史氏鲟聚为一支，表明在进化上与鲟形目的鱼类亲缘较近。

2.3 不同组织中IGFs的表达水平

达氏鲟IGFs在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、性腺、肌肉、肠、鳃、皮肤、眼、脑组织中均有表达，其表达量在各组织中不尽相同(图4)。其中，IGF-1在眼睛中的表达量最高，显著高于其他组织(P<0.05)，肝脏和性腺次之，在脾脏、鳃、肾脏中表达量较小，在皮肤中表达量最低。IGF-2在肝脏中的表达量最高，性腺次之，显著高于其他组织(P<0.05)，在肠道、脾脏中表达量较小，同IGF-1类似，IGF-2在皮肤中的表达量最低。

2.4 饥饿胁迫下达氏鲟IGFs表达量的变化

达氏鲟肝脏、肠和肌肉组织中IGF-1和IGF-2mRNA表达量在饥饿期间出现不同的变化。饥饿1 d后，肝脏和肠道中的IGF-1呈现上升的趋势(图5)，随后第3、7和14天时的表达量均显著下降(P<0.05)。而肌肉中的IGF-1在第3、7天时出现下降趋势，但相较于第0天的表达量无显著差异(P>0.05)，饥饿14 d，其表达量开始出现了显著下降(P<0.05)。IGF-2在饥饿第1天后也出现上调表达的趋势(图6)，但饥饿第3、7和14天时其表达量在所有检测的组织中与第0天相比均无显著差异(P>0.05)。

灰色阴影部分表示起始密码子，*表示终止密码子，方框内为多聚腺苷酸化信号The initiation codon was highlighted in light grey and termination codon was shown by * while the polyadenylation signal was in box

灰色阴影部分表示起始密码子，*表示终止密码子，方框内为多聚腺苷酸化信号The initiation codon was highlighted in light grey and termination codon was shown by * while the polyadenylation signal was in box

图3 达氏鲟IGFs与其他脊椎动物的系统发生树

3 讨 论

20世纪90年代以来，国内外学者已成功分离出鱼类的IGF-1和IGF-2基因cDNA序列[3-11]。研究发现，不同鱼类的IGF cDNA序列同源性高，蛋白质一级结构高度保守[19]。达氏鲟IGF-1和IGF-2由信号肽和B、C、A、D、E 5区组成，IGF-1和IGF-2的相似性为42.1 %。通过与其他鱼类的氨基酸多重对比，B、C、A、D保守性较高，信号肽及E区同源性较差。达氏鲟IGF-1与史氏鲟(A.schrenckii)、密西西比铲鲟(Scaphirhynchusplatorynchus)的同源性较高，均为96 %，与其他物种的同源性则为60 %左右。IGF-2与与欧鳇(Husohuso)、西伯利亚鲟(A.baeri)、小体鲟(A.ruthenus)、波斯鲟(A.persicus)的同源性较高，均在90 %以上，与其他物种的同源性为70 %左右。达氏鲟隶属鲟属，从构建的系统进化树可以看出，达氏鲟与史氏鲟、密西西比铲鲟、欧鳇、西伯利亚鲟、小体鲟、波斯鲟等IGF的同源性很高，与分类地位相近的鲟、鳇等出现在同一分支，与鲤形目、鲑形目等鱼类相距较远，这与其传统分类地位相一致。

不同字母表示差异达到显著水平The different letters stand for significant difference

图5 饥饿胁迫下不同组织中IGF-1的相对表达量

图6 饥饿胁迫下不同组织中IGF-2的相对表达量

一般情况下，IGFs对肌肉、脑、生殖系统、免疫系统、消化系统、生长等都有重要作用[20]，其主要在肝脏中表达，在其他组织也有一定的表达[21]。本研究发现，IGF-1和IGF-2在肠、肝脏、肌肉、脑、皮肤、脾脏、鳃、肾脏、心脏、性腺和眼睛中均有表达，也充分证明IGFs在达氏鲟中是一个广泛表达的基因。近年来研究表明，IGF-2主要与动物的胚胎生长和发育相关，IGF-1主要负责动物的胚后生长。Manfred[22]等研究发现，莫桑比克罗非鱼大部分器官组织都能分泌IGF-1，如肝、胰、胃、肠、肾、生殖腺、脑、心和眼等，这些器官和组织通过自分泌、旁分泌方式分泌IGF-1，然后通过IGF-1调节来发挥生物效应。2007年，Otteson[22]等发现IGF-1和IGF-1R在视网膜中表达，并显著高于其它组织，外源的GH能显著提高靶组织中IGF-1的表达量，并提高视网膜原始细胞扩增。本研究中，IGF-1在达氏鲟眼睛中表达量最高，推测其可能参与到达氏鲟眼睛视网膜的发育过程中。其次，IGF-1在肝脏中也有较高的表达，但肠、皮肤、脾脏、鳃、肾脏中的表达量低，这与其他硬骨鱼中IGF-1的表达模式相似，说明IGF-1主要由肝脏参与合成，少数可由其他器官产生和分泌[24-25]。IGF-2在鱼类的多组织中表达，是控制动物生长和脂肪沉积的重要基因之一。不同鱼类各组织IGF-2的表达量不尽相同，其中，鲤(Cyprinuscarpio)、半滑舌鳎(Soleasenegalensis)、金头鲷(Sparusaurata)等鱼类中肝脏的IGF-2表达量最高，鳜(Sinipercachuatsi)在脑中表达量最高，三长棘赤鲷(Pagrusauriga)在鳃和心脏中表达量最高[26]。IGFs是生长轴和生殖轴相交联的关键因子，性腺中也存在生长激素生长调控轴和一些性腺局部的调节因子，准确调控卵巢发育与成熟的变化。Cao[4]等研究发现，鱼类IGF-2参与鱼类性腺发育过程，能诱导鱼类卵母细胞成熟和颗粒细胞的增殖与分化。林权卓[23]等通过对双棘黄姑鱼的研究发现，IGF-2在各组织中均广泛表达，在卵巢成熟期的IGF-2表达量较高，具有促进卵巢成熟的作用。Sharon[21]等研究发现，IGF-2在卵泡层和卵母细胞均有表达，更多的参与动物繁殖旁分泌/自分泌系统。Gentil等[27]通过观察虹蹲性周期发现，IGF-2参与卵黄的生成，在鱼类生长发育中具有重要生理作用。本研究中，IGF-2在不同组织中出现一定的差异表达，除肝脏以外，该基因在性腺的表达量显著高于其他组织，由于本实验所用达氏鲟样本正处于早期性腺分化阶段，所以推测IGF-2可能参与到达氏鲟生殖细胞发育和早期性腺分化等途径中。

饥饿条件下，鱼类的激素分泌、糖源合成代谢[28]、脂肪代谢[29]和能量收支[30]会发生一定的改变。IGFs的表达和活性与营养状况呈正相关的关系，鱼类在受到饥饿胁迫时GH和IGF-1会迅速进行反馈调节。沈文英等[31]分析了饥饿和恢复投喂条件下，异育银鲫肝脏IGF-1表达量的变化，发现饥饿期肝脏IGF-1mRNA表达量呈下降趋势，恢复投喂后血液中的IGF-1迅速恢复到对照组水平。Wood等[32]研究发现，营养状况通过调节IGF的转录来实现对IGF的调控，长期饥饿将导致血液中IGF-1水平的持续降低。本研究结果显示，在饥饿条件下，肝、肠和肌肉组织中的IGF-1总体呈下调表达的趋势，与斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)[33]、红点鲑(Salvelinusalpinus)[34]、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[35]的研究结果相似。饥饿时间与IGFs的表达也存在一定的关系，尼罗罗非鱼[36]在饥饿7 d后，肝胰脏mRNA表达丰度明显降低，异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[31]在饥饿第14天后IGFs表达显著降低，大口黑鲈(Micropterussalmoides)[37]在禁食3周后，肝脏中的IGF-1mRNA水平显著低于对照组。然而，与以往鱼类研究不同的是，本研究发现IGFs的表达量在饥饿短时间内出现小幅度的上升，随后逐渐下降，这与小鼠在48 h内的IGF-1mRNA表达量变化趋势一致[38]。除此以外，本研究还发现，肝脏和肠道的IGF-1表达量在饥饿第3天开始就出现显著下降，而肌肉中的IGF-1表达量在第14天时才开始显著下降，推测达氏鲟IGF-1在肌肉中对于饥饿胁迫的响应时间要慢于肝脏和肠道。而达氏鲟IGF-2在饥饿胁迫下的表达模式与IGF-1存在较大差别。在饥饿第1天时，IGF-2在检测的各组织中均迅速上调表达，但在随后的第3天开始就下降到初始表达水平，随后其表达量与第0天相比均无显著差异，到饥饿第14天时也无显著下降，推测IGF-2可能不参与达氏鲟饥饿胁迫响应的途径中。IGF-1和IGF-2对饥饿胁迫的不同响应模式也进一步说明IGF-1和IGF-2在达氏鲟中行使着不同的生物学功能。

4 结 论

本研究首次克隆了达氏鲟IGF-1和IGF-2两种胰岛素样生长因子的cDNA全长序列，并分析了其组织分布和在饥饿胁迫下的表达模式。研究发现饥饿胁迫会显著影响达氏鲟IGF-1mRNA的表达水平，而IGF-2的表达模式整体无显著变化，推测该2种胰岛素样生长因子在达氏鲟中发挥着不同的生物学功能。IGFs是一类重要的生长调控因子，本研究可作为达氏鲟生长调控、营养调控与基因表达模式关系的研究基础，如今后把该基因作为主效功能基因用于分子标记辅助育种，将更好的促进该物种的选育与保护。