血清标志物在肝细胞肝癌早期诊断中的研究进展及应用前景

刘毓键，马明洋

(天津医科大学总医院普通外科，天津 300052)

我国是肝癌高发地区之一，受肝炎病毒感染、黄曲霉素、饮酒、非酒精性脂肪肝、肥胖等危险因素的影响，我国肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率居高不下，占世界总发病人数的55%，是我国发病率排在第四位的恶性肿瘤[1]。肝癌的恶性程度高，病死率高，预后差，主要原因是肝癌早期临床症状隐蔽、影像学检查不易发现(对于早期肝癌，超声检查的灵敏度仅为63%)，往往确诊时病情已达中晚期，导致治疗后复发率极高，严重威胁患者的生命[2]。目前对于肝癌的治疗，最有效的是肝癌早期手术，且早期诊疗患者的5年生存率超过70%，远高于肝癌晚期患者(低于16%)[3]。因此，提高早期筛查诊断效率，早发现、早诊断、早治疗，是提高患者生存率、延长生存时间的有效途径。肝癌的检测主要包括活组织检测、血清学检测、影像学检查，其中，血清学检测具有便捷、经济、伤害小、操作性强等优点，有较大的临床应用价值，但因缺乏有效的早期肝癌检测诊断的标志物而未能充分实施。现就血清标志物在HCC早期检测中的研究进展及应用前景予以综述，旨在为该领域的后续研究提供参考，切实提高HCC的早期诊断效率。

1 传统血清标志物

甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是一种高表达于胚胎发育时期参与多种物质转运的糖蛋白，出生后AFP的表达快速降低(血清AFP水平低于10 ng/mL)，一般不能检出。慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清AFP水平异常，尤其肝癌患者体内AFP水平持续升高，是目前唯一普遍应用于HCC临床诊断的血清标志物。AFP对于HCC筛查的灵敏度和特异度很大程度上依赖其临界值的设定，一般AFP水平高于400 ng/mL几乎可确诊HCC，但由于年龄、性别、肝癌早期血清AFP水平低(<200 ng/mL)等因素的影响，其检出率较低(39%～65%)，容易漏诊；若将诊断标准降至20 ng/mL则不能排除慢性肝炎等情况，导致特异性降低，误诊率较高[4]。相比单纯检测AFP，AFP联合鳞状细胞癌相关抗原或再合并鳞状细胞癌相关抗原免疫复合物、AFP免疫复合物检测肝癌的灵敏度分别提高至90.83%(特异度为44.44%)[5]或85%(特异度为81%)[6]。另外，参考我国香港等地区的经验，AFP联合超声检查也可显著提高HCC的早期检出效率[7]，而AFP联合超声检查也是现今最普遍的HCC监测手段。Liu等[8]将经过肝炎指标校正的AFP，即AFP/(丙氨酸转氨酶＊天冬氨酸转氨酶)应用于人群样本检测，发现校正AFP对于HCC诊断的特异性和预测能力高于AFP，同时该指标与肿瘤大小、癌栓形成具有相关性。基于以上研究，AFP的检测价值有限，需要新型生物标志物的代替或补充，帮助HCC高危人群筛查和早期诊断。

2 新型血清标志物

2.1AFP异质体 根据与扁豆凝集素亲和力的不同，AFP可以分为三种异质体，即AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3，其中AFP-L3与扁豆凝集素亲和力很高。AFP-L3仅由肝癌细胞产生，但在肝炎等慢性肝病中无表达，因此，可以作为HCC的特异性标志物。AFP-L3的灵敏度不高，对于肿瘤直径<2 cm肝癌的检出率为35%～45%，对于肝癌的总检出率仅有50%～60%，与传统血清标志物AFP相比无显著优势，但其特异度高达95%以上[4]，能够更好地区分肝癌与肝炎患者，适用于HCC高危人群的筛查和监测。研究人员通过检测血清中AFP-L3含量占总AFP的比例(即AFP岩藻糖基化指数或AFP-L3%)，能够在血清AFP水平较低(20～200 ng/mL)的肝炎或肝硬化人群中区分肝癌患者，可在HCC早期临床诊断中减少漏诊的发生[9]。同时，AFP-L3可以在一定程度上预测肝癌的恶性程度和复发、转移情况[10]，因此，对于HCC患者的术前预后和随访调查也都具有重要意义。另外，检测方法的不断创新已将AFP-L3的最低检出量降低至0.1 ng/mL，AFP-L3%水平在AFP水平低至3 ng/mL的样本中仍可检出(以前样本AFP水平最少应达到10～20 ng/mL)[11]，并且检测时间显著缩短，更适于批量操作，便于临床的推广应用。总之，AFP-L3对HCC的特异性显著优于AFP，可以作为补充以减少AFP在HCC早期诊断中误诊的发生。

2.2脱-γ-羧基-凝血酶原(des-γ-carboxy-prothrombin，DCP) DCP又称人异常凝血酶原，是由维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导产生的蛋白质。有研究者首次发现约90%的HCC患者的血清中含有DCP[12]，此后的试验证据显示HCC患者血清DCP水平升高显著，而在肝炎肝硬化患者血清中只有轻度升高，血清DCP水平或可作为HCC筛查的有效标志物[13]。手术切除治疗后，DCP水平降低并维持低水平者，HCC复发风险较低[14]；经肝脏移植的HCC患者中，移植前DCP水平低的患者HCC复发的比例低，患者存活率较高[15]；Orita等[16]发现，1例HCC患者术后出现肝内转移时，DCP水平显著升高而AFP水平正常，并且在发现股二头肌转移前7个月即能检测到DCP水平异常升高，术后出现肺转移时DCP水平亦显著升高，这可能是由于DCP水平与微血管侵袭具有相关性，从而对HCC术后复发具有较高的预测价值。尽管DCP在肝癌中的表达特异程度高，但其血清水平与肿瘤大小呈正相关，因此，对于早期HCC和小肝癌患者，DCP的灵敏度不佳(肿瘤直径<2 cm，灵敏度为18%～50%；直径为2.1～3.0 cm，灵敏度为35%～60%)，不宜作为HCC早期筛查与诊断的独立生物标志物，需要与其他标志物联用以达到更好的检测效果[17]。已有证据表明，DCP联合AFP和(或)AFP-L3可将早期HCC检测的灵敏度提高至91%[18]。DCP检测现今已在日本、韩国、印度尼西亚等地开展临床应用[19]，而我国尚未实施。目前，针对亚洲尤其是我国人群的DCP大规模、多中心的临床研究正在进行，并且取得了一定进展[20]，结果令人期待。

2.3高尔基体糖蛋白73(Golgi protein-73，GP73) GP73是一种存在于高尔基体的Ⅱ型跨膜糖蛋白，通常认为，在正常肝脏中GP73主要表达于胆管上皮细胞，肝细胞无表达或仅少量表达，血清GP73水平低；而肝癌患者体内的肝细胞则可大量产生GP73(是肝脏正常状态下的36～72倍)并进一步释放到血清中，造成血清GP73水平显著上调[4]。Marrero等[21]的研究显示，在早期HCC的诊断方面，GP73的灵敏度为62%，远高于AFP(灵敏度为25%)，表明GP73对于早期HCC的诊断效果优于AFP。综合多项病例-对照研究的结果，GP73单独诊断HCC的总体灵敏度为69%～83%，特异度为73%～97%[22]；若联合AFP诊断，可将HCC检出率从74.6%(特异度97.4%)提升至89.2%(特异度85.2%)[23]。研究发现，激活的肝星状细胞也可以过度表达GP73[24]。同时，血清GP73水平与慢性乙型肝炎患者的肝脏纤维化病变程度具有相关性[25]。在一项针对我国人口的研究中发现，乙型肝炎病毒感染的肝癌患者血清GP73水平在所有检测组中最高，血清GP73诊断乙型肝炎病毒相关性肝癌的灵敏度高达77.4%(特异度为83.9%)，显著优于AFP(48.4%)[26]。我国乙型肝炎流行率较高，并且很大一部分肝癌患者是由肝炎转化而来，因此，对于我国人口早期肝癌的诊断，GP73可能具有尤为重要的意义。但是与AFP、AFP-L3和DCP相比，GP73对于HCC术后复发的预测并无优势，而DCP则与肿瘤侵袭能力显著相关，在四者中预后价值最高[27]。作为一种重要的血清标志物，GP73能否应用于临床还需要通过更大规模的队列研究进行检验。

2.4骨桥蛋白(osteopontin，OPN) OPN是一种整合素结合磷酸化蛋白，在结肠癌、胰腺癌和乳腺癌等多种癌症中表达均高于正常水平[28]。肝癌患者癌组织中的肝细胞和浸润巨噬细胞能够大量产生并释放OPN，血清OPN水平显著升高，并且与肝癌分期具有相关性，同时OPN的表达水平与肝癌肝内转移和复发也具有相关性；更重要的是，肝癌患者血清OPN水平显著高于肝炎或肝硬化患者，在乙型肝炎病毒感染的亚洲人群中，肝癌检出率高于93%，表明OPN对肝炎和肝硬化等高危人群的筛查有重要意义[29]。中国、美国、泰国等人群的病例-对照研究结果均显示，OPN对早期HCC的诊断效率显著高于AFP，若两者联合检测则诊断率可进一步提高[25-26]。一项涉及10个欧洲国家人群的大型队列研究表明，OPN单独或联合AFP检测对HCC的诊断效果优于AFP单独检测，且血清OPN水平越高，HCC患病风险越高[30]。而一项针对韩国人群的研究则发现，OPN诊断HCC的准确率低于AFP和DCP，认为OPN能替代传统的标志物用于HCC的诊断[31]。因此，还需要进一步在不同地区人群中进行前瞻性研究以验证OPN用于HCC早期诊断的可行性。

2.5磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3) GPC3在健康成人、肝硬化和肝炎患者的肝组织或血清中均无明显表达，但在HCC患者中显著升高，并且升高水平与肿瘤大小和肿瘤分期无关，可能是一种潜在的肝癌特异性标志基因[32]。对肿瘤直径<2 cm的小肝癌，GPC3检测的灵敏度超过60%[31]。Capurro等[33]的研究结果显示，GPC3单独检测HCC的灵敏度仅为53%(特异度为95%)，联合AFP检测灵敏度可以提高至82.4%。有研究结果显示GPC3对于肝癌良好的特异性，特别是在AFP和DCP阴性的HCC患者中，应用GPC3检测的阳性率可达30%～50%[34]。另外，在肝炎相关性肝癌的诊断方面，GPC3单独检测时灵敏度为38.5%(特异度为100%)，而与AFP、DCP联合检测时灵敏度高达80.8%，三者联用对于肝炎相关性肝癌的诊断以及术后监测均具有潜在价值[35]。但一项荟萃分析的结果显示，在肝硬化与肝癌的区别诊断方面，GPC3的特异度不如AFP(灵敏度相近)，两者联用效果更好[36]。

2.6Midkine(MDK) MDK是一种肝素结合蛋白，在健康成人的肝组织中不表达，在大多数肿瘤中高表达，参与肿瘤的发生、发展过程[37]。MDK是近年来通过基因芯片技术筛选出的具有潜在临床应用价值的HCC早期诊断血清标志物之一[38]。一项涉及我国人群的多中心临床研究表明，与AFP相比，MDK单独进行HCC检测具有较高的灵敏度(83.6%比51.9%)和相似的特异度(83.9%比86.3%)；对AFP阴性的HCC，其灵敏度高达89.2%，两者联合诊断可将检测效率提升至94.9%；在早期HCC检测中，MDK的表现也显著优于AFP(80%比40%)；同时该研究还发现，肝癌患者术后血清MDK水平显著降低，伴随肿瘤的复发可再次升高，表明该标志物对术后的随访监测也有一定意义[39]。而我国的另一项前瞻性研究则发现，血清MDK水平的急剧升高大多发生在肝癌终末期患者中，认为MDK水平监测不适用于对HCC高危人群的筛查和术后缓解患者的随访监测[40]。因此，仍需要更进一步的探究。

2.7Dickkopf-1 (DKK1) DKK1是一种分泌蛋白，在包括肝癌在内的多种癌症患者体内过表达。DKK1水平在HCC发病的早期即可升高，并在肝癌术后显著降低[41]；高表达DKK1与不良预后有关[42]，提示血清DKK1水平对HCC的早期诊断和预后均具有重要意义。基于中国人群的多中心回顾性横断面研究发现，对于早期HCC患者，DKK1的灵敏度高于AFP，可以减少对AFP阴性HCC的漏诊；同时具有更好的特异性，能够区分大部分AFP假阳性的慢性肝炎肝硬化患者，因此，应用DKK1进行联合检测可以作为AFP的补充，提高检测效率[43]。

2.8岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase，AFU) AFU广泛表达于哺乳动物细胞的溶酶体中，参与岩藻糖蛋白的代谢。Deugnier等[44]首次报道了HCC患者血清AFU水平增高，提出AFU为HCC诊断的潜在标志物。随后Giardina等[45]发现，当阈值定为443 nmoL/(mL·h)时，其灵敏度和特异度分别为76%和90.9%；同时通过对肝硬化患者进行随访调查发现，约44%的肝硬化患者在超声发现局灶性病变前6～9个月AFU水平即显著增高。也有研究认为，AFU对早期HCC的诊断效率较低，与AFP相比并无优势[46]。而与其他标志物(如AFP、胸苷激酶1)联用则可提高诊断效率[47]。因此，需要进一步确认其诊断价值。

2.9甘露聚糖结合凝集素(mannose binding lectin，MBL) MBL由肝细胞合成，通过激活补体系统或介导巨噬细胞吞噬作用参与固有免疫调节，因此，MBL基因突变及其水平的改变可能导致对肝炎病毒的易感性增强，并促进肝炎向肝硬化、肝癌的进展[48]。Jalal等[49]的研究显示，血清MBL水平可以作为预测慢性丙型肝炎病毒感染进展为HCC的标志物，而Segat等[50]则认为，MBL与肝炎相关HCC或其他因素诱导HCC的发生无关。因此，MBL对肝癌的指示作用还需要进一步探究。

2.10循环微RNA(microRNAs，miRNAs) 循环miRNAs是一类存在于血液、尿液等体液中或外泌体、微粒等膜囊泡中的小分子非编码RNA。研究发现，乙型肝炎病毒或慢性乙型肝炎相关性HCC患者的血清中某些miRNAs水平出现异常，且miRNAs稳定性好、易于检测，因此，也可以作为生物标志物应用于肝癌的诊断和监测[51]。研究者通过比较正常人、肝炎和肝癌患者血清miRNAs的组成和含量，筛选出一系列潜在标志物，如miR-21[52]、miR-122[53]、miR-223[54]、miR-224[55]、miR-26a[52]和miR-375[56]等，并指出这些miRNAs单独或者联合应用对HCC的早期诊断较传统标志物更具应用前景。但直至目前，这些研究仍处于临床前期研究阶段，要应用到临床还有诸多问题需要解决，如miRNAs种类众多而每个样本的检测量有限，如何确定有效的miRNAs组合还需要更多的研究支持，如何能够一次检测更多的miRNAs还需要技术上的突破；选用不同类型的临床样本(血浆、血清、尿液)可能直接影响检测结果，因此，在样本的选择上还需进一步探索；因缺乏各种miRNAs的标准参考值，检测结果无法通过独立的验证加以证实等。

研究者们利用蛋白质组学技术筛选出了众多新型潜在血清标志物[57]，如趋化因子配体15[58]、补体蛋白3a[59]、波形蛋白[60]、N-聚糖[61]、磷酸甘油酸激酶1[62]等，这些新型标志物仍处于临床前试验阶段，其诊断价值有待进一步验证。此外，AFP是目前唯一通过了5个阶段测试的HCC生物标志物；DCP、AFP-L3、GP73和OPN正处于第3阶段，被认为是目前最有潜力的新型血清标志物；其他新型标志物仍停留在第1～2阶段(表1)。同时，应用蛋白质组学技术建立的诊断模型能够在HCC的早期诊断中取得较好的效果，有研究者将蛋白质组学技术建立的诊断模型与标志物AFP联用，结果HCC诊断的灵敏度提高至95%，同时特异度高达98%[63]。尽管如此，受技术等条件的制约，目前蛋白质组学技术还难以推广使用。

3 小 结

每一种肿瘤标志物在诊断上都有其特定的优势，但也存在局限性。就目前的结果看来，特别是对于HCC的早期检测，单独检测任何一种生物标志物均未能达到理想的诊断目标，但应用不同标志物

表1 血清生物标志物的主要优势作用及目前所处验证阶段

AFP：甲胎蛋白；DCP：脱-γ-羧基-凝血酶原；GP73：高尔基体糖蛋白73；OPN：骨桥蛋白；GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；MDK：Midkine；DKK1：Dickkopf-1；AFU：岩藻糖苷酶；MBL：甘露聚糖结合凝集素；miRNAs：微RNA；Proteomics：蛋白质组学；CCL15:趋化因子配体15；Vitronectin：玻连蛋白；HSP27：热激蛋白27；Vimentin：波形蛋白；N-Glycan:N-聚糖；PGK1：磷酸甘油酸激酶1；第1阶段：临床前试验；第2阶段：病例-对照研究；第3阶段：回顾性纵向研究；第4阶段：前瞻性筛查研究；第5阶段：随机对照试验

进行联合检测则能在提高肝癌检出效率的同时减少漏诊、误诊的发生。值得注意的是，并非联合检测的项目越多其诊断效果越好，且过度检测也会增加不必要的经济负担。同时，对肝癌高危人群实施定期筛查，随时间纵向评估各项标志物的动态变化，更有利于及时发现异常，提高诊断效率。因此，在不断利用新技术挖掘更加灵敏和特异的标志物的同时，也应在已发现的标志物中探索适合各类HCC患者的联合检测策略，实现HCC的早期诊断。